解決免疫共沉淀（Co-IP）中的抗體輕重鏈污染問題

解決免疫共沉淀（Co-IP）中的抗體輕重鏈污染問題

1.    免疫共沉淀-互作研究經典方法

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CoIP）是研究蛋白-蛋白間相互作用的經典方法，常用于發現蛋白的互作網絡、鑒定兩蛋白的互作關系。

CoIP的設計原理是，假設一種已知蛋白是某個大的蛋白復合物的組成成員，那么利用這種蛋白的特異性抗體，就可以將整個蛋白復合物從溶液中“拉"下來（常說的“pull-down"），進而可以用于鑒定這個蛋白復合物中的其他未知成員。

CoIP的特點可以概括為兩點，第一是天然狀態蛋白，第二是蛋白復合物。

大致流程如下圖所示：

2.哪有那么簡單

上面講了原理和流程，看起來很好理解。但研究中往往不像理論那么順利。

在做CoIP實驗過程中往往會遇到目的蛋白與抗體輕鏈（25kDa左右）或者抗體重鏈（55kDa左右）的分子量接近的情況，導致IP-WB檢測時無法判斷目的蛋白條帶（如上圖）。

如何解決這種問題，困擾了非常多的小伙伴。

3. 問題的根源

其實產生抗體輕、重鏈條帶污染的主要原因是，我們上二抗的時候，PVDF膜上有兩種一抗：

（1）用于CoIP的一抗脫落后跑電泳并轉印到膜上（上圖紅圈所示）

（2）IP-WB時加入的一抗（上圖紅色箭頭對應的一抗）。

二抗同時識別上面兩種一抗，導致除了目標條帶（紅色箭頭）外，還產生抗體的輕鏈和重鏈條帶（黑色箭頭）。

4. 解法

要解決該問題主要就是處理掉圖中的輕、重鏈條帶。

那我們知道做WB要有條帶需要2個要素：目標蛋白、抗體及發光基團。

解法就是分別解決這3個要素，任意一個要素解決了問題就解決了。

1)  Co-IP抗體共價偶聯到磁珠或者Agarose上——這樣在洗脫的時候，抗體就不會被洗到CoIP產物中去。

（產品推薦：A10003 NHS-Activated Magarose Beads，或者M2001X系列Tag-Agarose beads產品）；

 2)  IP-WB檢測一抗直接標記HRP，WB實驗過程中不使用二抗——這樣就不會發生二抗識別CoIP產物中一抗抗體。

（產品推薦：M200系列HRP標記標簽抗體）；

 3)  使用一款只識別天然構象抗體的二抗——由于WB過程中，CoIP產物中一抗抗體變性，該二抗不會識別產生條帶。

（產品推薦：AbSmart系列二抗）；

上述3種方法中：購買共價偶聯好的Tag-Agarose beads或者HRP標記的標簽抗體，使用起來很方便，作為實驗選。

但是絕大多數一抗是沒有HRP標記的或者共價偶聯beads的，所以很多實驗室在做內源性蛋白Co-IP實驗時就會很煩惱，這時候使用避免抗體輕重鏈的AbSmart系列二抗，就可以有效地解決這類問題，作為內源性蛋白的Co-IP實驗的選。

另外如果Co-IP之后，需要質譜鑒定互作蛋白或修飾時，為了排除質譜檢測時抗體的干擾，可以選擇使用NHS- Activated Magarose Beads來共價偶聯一抗，然后做CoIP實驗將產物進行質譜檢測，這樣可以大大提高質譜檢出蛋白的數量和修飾位點的靈敏度。

下面給大家分享一個實驗結果案例：

南京沃博生物科技有限公司常備現貨

1.Tag-Agarose beads產品

M20012:Anti-Myc-Tag Mouse Antibody(Agarose Conjugated)

M20013:Anti-HA-Tag Mouse Antibody(Agarose Conjugated)

M20014:Anti-GFP-Tag Mouse Antibody(Agarose Conjugated)

M20018:Anti-DYKDDDDK-Tag Mouse Antibody(Agarose Conjugated)

2.HRP標記的tag產品

M20019: Anti-Myc-Tag Antibody (HRP Conjugated)

M20020: Anti-His-Tag Antibody (HRP Conjugated)

M20021: Anti-Ha-Tag Antibody (HRP Conjugated)

M20022: Anti-GFP-Tag Antibody(HRP Conjugated) 

M20025: Anti-GST-Tag Antibody(HRPConjugated) 

M20026: Anti-DYKDDDDK-Tag Antibody(HRPConjugated) 

3.避免抗體輕重鏈二抗產品

AbSmart-M21004:Goat Anti-Mouse IgG HRP(避免重鏈)

AbSmart-M21005: GoatAnti-Mouse IgG HRP(避免輕鏈)

AbSmart-M21006: GoatAnti-Rabbit IgG HRP(避免重鏈)

AbSmart-M21007: GoatAnti-Rabbit IgG HRP(避免輕鏈)

4.共價偶聯Agarose產品

A10003: NHS- ActivatedMagarose Beads

注意：

有同學反饋說使用共價偶聯好的Tag-Agarose beads產品，在做CoIP-WB檢測的時候，也會出現抗體輕重鏈。

詳細了解實驗流程后，發現是由于CoIP實驗的最后一步（互作蛋白洗脫步驟）操作錯誤導致。

即很多同學在3次PBST洗滌之后，直接就加入WB Loading buffer進行煮樣，然后就進行SDS-PAGE上樣了。這樣操作會導致共價偶聯的抗體被分離下來，在WB中出現抗體輕重鏈的條帶。

正確的操作應該是：1. 3次PBST洗滌之后，加入50-100ul的PH2.5-3.0的甘氨酸溶液（加入體積根據實驗需求自行調整）；2. 震蕩混勻，靜置30-60s，離心取上清（磁珠用磁力架）；3. 上清中按照體積比1:10（中和液/甘氨酸）加入中和液（中和液為PH9.0的Tris溶液）；4. 后續在上清液中正常加入WB Loading buffer操作即可。

為了方便大家實驗操作，Abmart為大家提供了配置好的洗脫液和中和液產品（貨號T10007），該產品也可以作為ProA/G產品的洗脫液和中和液。如果是使用Flag抗體進行CoIP實驗，可以使用3*DDDDK多肽（貨號T10004）進行洗脫，該產品針對非共價偶聯的Flag抗體進行的CoIP實驗，一樣可以起到避免抗體輕重鏈污染的問題。