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線粒體膜電位檢測試劑盒(Rhodamine 123) (Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit with Rhodamine 123)是一種以Rhodamine 123為熒光探針對線粒體進行染色并進行膜電位檢測的試劑盒。本試劑盒可用于活細胞線粒體膜電位的檢測，也用于細胞凋亡的檢測。本試劑盒可使用熒光顯微鏡、流式細胞儀、熒光酶標儀等熒光檢測設備進行檢測。

Rhodamine 123也稱2-(6-Amino-3-imino-3H-xanthen-9-yl)benzoic acid methyl ester，中文名為羅丹明123，分子式為C₂₁H₁₇ClN₂O₃，分子量為380.82，CAS號為62669-70-9。Rhodamine 123是一種通透細胞膜的黃綠色陽離子熒光探針，最大激發光波長為507nm，最大發射光波長為529nm。Rhodamine 123的化學結構式和激發、發射光譜圖參考圖1。

圖1. Rhodamine 123的化學結構式和激發、發射光譜圖。

本試劑盒檢測線粒體膜電位的原理如下。正常細胞中，Rhodamine 123能夠依賴線粒體跨膜電位進入線粒體基質，可發出明亮的黃綠色熒光；當細胞發生凋亡或壞死時，線粒體膜電位丟失，線粒體通透性轉換孔(MPTP)持續開放，引起線粒體跨膜電位(ΔΨm)的崩潰，Rhodamine 123從線粒體中釋放出來，從而導致線粒體內黃綠色熒光強度的明顯降低(Quench模式)。此外，Rhodamine 123探針在線粒體內過度聚集后會出現自發淬滅現象，線粒體內黃綠色熒光強度降低?？捎脽晒怙@微鏡、流式細胞儀、熒光酶標儀等儀器檢測細胞，通過熒光信號的強弱來確定線粒體膜電位的變化和凋亡或壞死的發生。

Rhodamine 123可以快速通過細胞膜，僅需幾分鐘就可以被具有活性的線粒體所捕獲(sequestered by active mitochondria)，并且對細胞沒有明顯毒性。

本試劑盒可以應用于大多數的哺乳動物細胞及酵母。由于Rhodamine 123在線粒體內的積累依賴于線粒體膜電位，因此本試劑盒僅限用于存活的細胞或組織的檢測，不可用于固定或凍存的細胞或組織的檢測。

本試劑盒提供的Rhodamine 123為1000X溶液，該溶液經過優化，對大多數細胞都適用。但為了得到滿意的結果，對于不同類型的細胞請自行進行一定摸索。Rhodamine 123的終濃度一般為0.1X-5X，*先的推薦終濃度為1X，染色時間通常為20~60分鐘。試劑盒提供的CCCP作為誘導線粒體膜電位下降的陽性對照，終濃度一般為1-20μM，*先的推薦終濃度為10μM。同時，本試劑盒提供了檢測緩沖液，該緩沖液可在一段時間內維持細胞的正常狀態，并給細胞提供一定的營養，效果比PBS或HBSS更好。使用本試劑盒檢測NRK-52E細胞線粒體膜電位變化的效果參考圖2。

圖2. 使用線粒體膜電位檢測試劑盒(Rhodamine 123)的檢測效果圖。正常的NRK-52E中，Rhodamine 123在線粒體內聚集發出明亮的黃綠色熒光；使用CCCP誘導使線粒體膜電位下降后，線粒體內黃綠色熒光強度明顯下降，幾乎*消失。

本試劑盒小包裝C2008S，如果用于流式細胞儀，每個樣品的檢測體系體積為0.5ml時，可以進行200次檢測；6孔板每孔檢測體系的體積為1ml時可以檢測100次，96孔板每孔檢測體系的體積為100μl時可以檢測1000次。

包裝清單：

保存條件：
 

-20℃保存，一年有效。其中Rhodamine 123 (1000X)需要-20℃避光保存。

注意事項：
 

熒光染料均存在淬滅問題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

本試劑盒僅限于用于存活的細胞或組織的檢測，不可用于固定或凍存的細胞或組織樣品的檢測。

檢測緩沖液經過過濾除菌處理，在使用時須注意避免微生物污染，否則很可能嚴重影響染色效果。如果檢測緩沖液發生渾濁等明顯的微生物污染，就不能繼續使用。

CCCP為線粒體電子傳遞鏈抑制劑，對人體有害，操作時請小心，并注意有效防護以避免直接接觸人體或吸入體內。

熒光酶標儀檢測時須使用適合熒光檢測的黑板或白板，建議使用96孔黑板

本產品僅限于專業人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內。

為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用說明：
1.Rhodamine 123染色工作液的配制：
6孔板每孔所需Rhodamine 123染色工作液的量為1ml，其它培養器皿的Rhodamine 123染色工作液的用量以此類推；對于細胞懸液每50-100萬細胞需0.5ml Rhodamine 123染色工作液。取適量Rhodamine 123 (1000X)，按照每1µl Rhodamine 123 (1000X)加入1ml檢測緩沖液的比例稀釋Rhodamine 123，混勻后即為Rhodamine 123染色工作液。
注1：配制Rhodamine 123染色工作液時注意避光，且須現配現用，不能長期保存。
注2：本試劑盒中提供的檢測緩沖液含有Ca²⁺，能夠在一段時間內維持細胞的正常狀態，并給細胞提供一定的營養，效果比PBS或HBSS更好；檢測緩沖液也可用細胞培養液代替，但培養液中不能含有血清，否則會影響Rhodamine 123的染色效果。
注3：染色工作液中Rhodamine 123的最終濃度需根據不同細胞系和實驗體系通過預實驗進行優化。Rhodamine 123的推薦工作濃度為1X，可以在0.1X-5X范圍內摸索最佳工作濃度。
2.陽性對照的設置：
把試劑盒中提供的CCCP (10mM)推薦按照1:1000的比例加入到細胞培養液中，稀釋至10µM，處理細胞20分鐘。隨后按照下述方法加入Rhodamine 123染色工作液，進行線粒體膜電位的檢測。對于大多數細胞，通常10µM CCCP處理20分鐘后線粒體的膜電位會*喪失，Rhodamine 123染色后觀察應呈弱黃綠色或幾乎無熒光；而正常的細胞經Rhodamine 123染色后應顯示明亮的黃綠色熒光。對于特定的細胞，CCCP的作用濃度和作用時間可能有所不同，需自行參考相關文獻資料或自行摸索確定。
3.對于懸浮細胞：
a.細胞按照實驗設計進行一定處理后，計數。取適量細胞600×g室溫離心5min，棄上清，加入適當體積的Rhodamine 123染色工作液重懸細胞，使細胞密度約為1×10⁶/ml。
b.細胞培養箱中37℃孵育20-60min，不同的細胞最佳孵育時間不同。以20min作為初始孵育時間，對孵育時間進行適當優化以得到最佳的效果。
c.37℃孵育結束后，600×g室溫離心5min，沉淀細胞。吸除上清，注意盡量不要觸及細胞。
d.用37℃預熱的細胞培養液洗滌2次：加入1ml 37℃預熱的細胞培養液重懸細胞，600×g離心5分鐘，沉淀細胞，棄上清；再加入1ml 37℃預熱的細胞培養液重懸細胞，600×g離心5分鐘，沉淀細胞，棄上清。
e.再用適量細胞培養液重懸后，用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察，也可以用熒光酶標儀或流式細胞儀分析。
4.對于貼壁細胞：
注意：對于貼壁細胞，如果希望采用熒光酶標儀或流式細胞儀檢測，可以先收集細胞，重懸后參考懸浮細胞的檢測方法。熒光酶標儀如果能采用底讀的方式進行熒光檢測，也可以使用96孔板等進行貼壁培養檢測的。
a.對于6孔板的一個孔的細胞，吸除培養液，根據具體實驗如有必要可以用PBS或其它適當溶液洗滌細胞一次。
b.加入1ml Rhodamine 123染色工作液。細胞培養箱中37℃孵育20-60min，不同的細胞最佳孵育時間不同。以20min作為初始孵育時間，對孵育時間進行適當優化以得到最佳的效果。
c.37℃孵育結束后，吸除上清，用預熱的細胞培養液洗滌2次。
d.加入2ml預熱的細胞培養液，培養液中可以含有血清和酚紅。
e.熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下觀察。
5.對于純化的線粒體：
a.準備好Rhodamine 123染色工作液。
b.0.9ml Rhodamine 123染色工作液中加入0.1ml總蛋白量為10-100µg純化的線粒體。
c.用熒光酶標儀或熒光分光光度計檢測：混勻后直接用熒光分光光度計進行時間掃描(time scan)，激發波長為507nm，發射波長為529nm。如果使用熒光酶標儀，可在軟件中把檢測對象設置為FITC，即可以檢測Rhodamine 123。另外，也可以參考下面步驟6中的波長設置進行熒光檢測。
d.用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察：方法同下面的步驟6。
6.熒光觀測和結果分析：
Rhodamine 123的最大激發波長為507nm，最大發射波長為529nm。如使用熒光顯微鏡觀察，可以參考觀察FITC等其它綠色熒光時的設置。黃綠色熒光變弱說明線粒體膜電位下降，并且該細胞很可能處于細胞凋亡早期。通過對比實驗組與陰性對照組測量的Relative fluorescence values (RFU)，可以得出藥物處理后線粒體內Rhodamine 123探針熒光強度的變化。此處的陰性對照為僅含檢測緩沖液的未經染色的細胞樣品。
注：流式檢測應獲得兩個相對獨立的細胞群：明亮綠色熒光的正常細胞群和弱綠色熒光的凋亡或壞死細胞群。