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對于熒光直標一抗，需要注意以下四點：

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1.選擇熒光標記要匹配

熒光直標抗體的一個主要優勢在于它為多重檢測提供了機會，比如現在一些先進的流式細胞儀能檢測每個細胞中20多個離散參數。在設計多重實驗時，應考慮每種熒光基團的*性質，如zui大吸收波長和zui大發射波長，消光系數和斯托克斯位移等因素。

對于免疫熒光分析方法，人們要同時檢測組織或細胞樣本中的多個抗原，常常會利用直標一抗進行免疫熒光共染色，這時一般盡量選擇光譜重疊比較少的熒光基團進行組合。比如，我們會選擇一個AF488標記的抗體和另一個AF647標記的抗體進行兩個不同蛋白的共染色。

對于流式細胞分析方法，我們對同時檢測多個抗原所需的熒光抗體的選擇相對容易一些。由于在流式細胞實驗過程中，熒光抗體對單細胞懸液的標記效果直接影響實驗的數據質量。因此，需要考慮各種影響流式抗體品質及檢測效果的因素，例如抗體特異性、熒光素信號強弱、熒光素標記方式、同型對照等。首先，選擇流式熒光抗體一定要滿足zui基本的條件：抗體有較好的目標蛋白特異性及適用的反應種屬。其次，要根據目標蛋白的豐度，選擇匹配的熒光素，來保證合適的熒光強度。如不同熒光標記在不同的儀器上強度不同，以FACS Calibur儀器為例：PE>APC>PE-Cy5>PerCP>FITC>PerCP-Cy5.5。通常來說，PEzui強，適用于弱表達抗原。FITC強度較弱，適用于強表達抗原，使用范圍比較廣。用戶需根據檢測的目標蛋白進行具體選擇。如果同時檢測多個指標：確認流式細胞儀能檢測多少個通道：流式抗體每個通道只能選擇1種熒光素。各個通道之間的熒光素可以隨意搭配。如：實驗者同時檢測三個指標，可以在下圖中綠色、黃色和紅色三個通道中各選一個適當的熒光素標記，FITC、PE和PE-cy5。切忌所有指標選擇同一個通道的熒光標記，以防止熒光的重疊和相互干擾，影響zui后結果。因此，流式細胞儀的通道越多，同一份樣本能同時做的表面/胞內標志就越多。常用熒光標記包括FITC, PE, PEcy5, PEcy5.5, APC等。我們這邊提供如下表格，幫助大家進行熒光素的選擇。

2.熒光試劑保存要妥當

盡管許多熒光基團具有相對的光穩定性，但在保存和染色過程中若未能避光,則可能導致熒光基團-抗體結合物降解，引起假陰性結果。熒光物質必須在建議溫度下小心保存，并始終注意避光，以保護其光譜完整性。另外，串聯的熒光基團（如PE-Cy5）對頻繁操作引起的不穩定性特別敏感，大家要注意。

3.操作方案要優化

1.免疫熒光操作方案的優化

對于免疫熒光實驗，從細胞樣品處理、固定、通透、封閉、抗體孵育到zui后的封片及觀察拍照，每步都非常關鍵，需要嚴格控制實驗流程中每個步驟的質量，才能zui終達到你的實驗目的。樣品制備（通俗的說法是細胞爬片）是免疫熒光實驗的di一步，其質量對實驗的成敗至關重要，這一步關鍵的是玻片的處理以及細胞的活力。固定和通透步驟zui重要的是根據所研究抗原的性質選擇適當的固定方法，合適的固定劑和固定程序對于獲得好的實驗結果是非常重要的。封閉zui，好用與指標一抗相同來源種屬的正常血清來進行封閉。對于直標一抗的免疫熒光染色，我們需要考慮抗體的建議稀釋度，以實現高的信噪比。若抗體濃度過低，則熒光信號較弱，可能難以與背景區分開，但抗體濃度過高，則會導致較高的背景染色。另外，要注意各步驟之間的*洗滌的重要性，利用生理溶液來洗滌，可去除未結合的熒光試劑，或那些只是粘在目標上而非特異性結合的熒光試劑，從而提高信噪比。zui后需要注意的是，標記好熒光的細胞片應盡早觀察，或者用封片劑封片后在4℃或-20℃避光保存，以免因標記蛋白解離或熒光減弱而影響實驗結果。盡管免疫熒光技術提供了準確的結果，但也存在一些缺點，包括自發熒光、熒光信號的淬滅。因此，可以針對上述問題，利用一些免疫熒光細胞處理試劑去進行預處理，以減少自發熒光或熒光信號的淬滅。有關免疫熒光技術的詳細講解，可以通過點擊我們近期發布的其他軟文來查看詳情。
2.流式細胞術操作方案的優化

流式細胞術操作方案的優化，主要包括以下幾個方面：

1. 1. 選擇固定劑

      （1）變性試劑：通過將蛋白變性再固定在細胞結構上的有機溶劑，如90%甲醇、70%乙醇等，變性試劑一般與細胞膜磷脂雙分子層有相互作用，因此同時具有破膜作用。如果采用變性試劑固定細胞，而抗體用來標記胞內蛋白，則不需要另外破膜。

      （2）交聯試劑：通過自由氨基基團使蛋白分子交聯起來固定蛋白，如4%多聚甲全、10%福爾，馬林溶液等，如果采用交聯試劑固定細胞，而抗體用來標記胞內蛋白，則需要另外破膜。

   2. 優化抗體使用濃度

      抗體滴定方法：用同種細胞，相同細胞數量與反應體積，加入不同量的抗體計算陽性峰熒光強度及信噪比（S/N>3）。

      （1）滴定的濃度范圍盡量大，至少5個左右。

      （2）滴定實驗條件要和實際實驗條件一致，如反應溫度、pH等。

      （3）弱表達或不分群的抗原不適合做滴定。

   3. 封閉Fc受體

      Fc受體是指細胞表面能夠與免疫球蛋白（IgG、IgA、IgM、IgE和IgD）結合的分子，存在于NK 細胞、肥大細胞、巨噬細胞、中性粒細胞的表面。FcR 能夠與抗體的Fc段結合，在檢測時產生假陽性。

      （1）商品化的 Fc Block試劑：重組人 IgG，小鼠 CD16/CD32 抗體。

      （2）人血清或相應物種的血清

   4. 排除死細胞

      死細胞的自發熒光水平很高，且容易攝取抗體導致非特異性結合，zui終影響實驗結果； 還可能會釋放DNA，DNA非常粘稠，會導致細胞成團，容易堵塞管路。

      區分死細胞的方法

      死細胞特性：細胞膜滲透性增強，失去膜完整性

      （1）DNA結合染料：PI、DAPI、7-AAD、TO-PRO-3等DNA染料只會進入細胞膜受損的細胞，結合到細胞的DNA上,圖三門R3中為7-AAD陰性，即為活細胞。

      （2）蛋白結合染料：結合細胞表面或膜內的游離胺，活細胞弱陽，死細胞強陽。可以用在固定標本中的，區分樣本固定細胞狀態。

       

4.要設立必要的對照

對于免疫熒光或流式細胞分析實驗，由于操作步驟比較多，同時在分析結果時無法像WB那樣可以根據分子量的大小區分非特異性識別，所以要得到一個可信的實驗結果，除了需要高質量的抗體，以及對實驗條件進行反復優化外，還必須設立嚴謹的實驗對照。對于熒光直標抗體，我們建議使用抗體的同型對照，即與抗體同一個來源種屬的正常同型IgG作為對照，對樣品進行平行染色，來確定抗體的染色是否特異。此外，我們還可以使用不表達目標的細胞或組織作為陰性樣品對照。同時，為了確保所有組分都正常發揮作用，那些已知表達目標的陽性對照也少不了。