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上海雅吉生物科技有限公司
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細胞壁不溶性化酶試劑盒
2021-1-6 閱讀(210)
細胞壁不溶性化酶（cell-wall binding acid invertase, B-AI）
試劑盒說明書
分光光度法 50 管/24 樣
正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定
測定意義：
蔗糖轉化酶（Invertase，Ivr）催化蔗糖不可逆地分解為果糖和葡萄糖，是高等植物蔗糖
代謝關鍵酶之一。根據適 pH，Ivr 分為酸性轉化酶（AI）和中性轉化酶（NI）兩種類型。
AI 的 pH 為 3～5。AI 分為可溶性 AI(S-AI)和細胞壁不溶性 AI（B-AI）兩種類型。
B-AI 存在于細胞間隙并結合在細胞壁上，主要參與韌皮部質外體卸載時蔗糖的分解，以維
持庫源之間蔗糖的濃度。
測定原理：
B-AI 催化蔗糖降解產生還原糖，進一步與 3,5－二硝基水楊酸反應，生成棕紅色氨基化合物，
在 510nm 有特征光吸收，在一定范圍內 510nm 光吸收增加速率與 B-AI 活性成正比。
自備用品：
可見分光光度計、臺式離心機、水浴鍋、移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。
試劑組成和配制：
提取液 1：液體 50mL×1 瓶，4℃保存;
提取液 2：液體 50mL×1 瓶，4℃保存;
試劑一：液體 50mL×1 瓶，4℃保存;
試劑二：粉劑×1 瓶，4℃保存；臨用前加入 25mL 試劑一充分溶解備用；用不完的試劑 4℃
保存;
試劑三：液體 30mL×1 瓶，4℃保存；
粗酶液提取：
按照組織質量（g）：提取液 1 體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL
提取液 1），進行冰浴勻漿。12000g 4℃離心 10min，棄上清，沉淀中加入 1mL 蒸餾水，充
分震蕩混勻，12000g 4℃離心 10min，棄上清，沉淀中加入 1mL 提取液 2 充分混勻，4℃浸
提過夜，12000g 4℃離心 20min，取上清置冰上待測。
測定步驟和加樣表：
試劑名稱（μL） 測定管 對照管
樣本 200 200
試劑一 800
試劑二 800
混勻， 37℃準確水浴 30min 后，95℃水浴 10min（蓋緊，以防水分散失），流水冷卻后充分
混勻（以保證濃度不變）
試劑三 500 500
混勻，95℃水浴 10min（蓋緊，以防止水分散失），流水冷卻后充分混勻， 510nm 處，蒸餾
水調零，記錄各管吸光值 A，如果吸光值大于 2，可以用蒸餾水稀釋后測定(計算公式中乘
以相應稀釋倍數)，ΔA=A 測定-A 對照。
B-AI 活性計算：
標準條件下測定的回歸方程為 y = 0.0016x -0.001；x 為標準品濃度（μg/mL），y 為吸光值。
（1）按蛋白濃度計算：
單位的定義：37℃每 mg 蛋白每分鐘產生 1μg 還原糖定義為一個酶活性單位。
B-AI 活性（μg/min/mg prot）＝[(ΔA +0.001) ÷0.0016×V1]÷(V1×Cpr ) ÷T=20.8×(ΔA +0.001)
÷Cpr
（2）按鮮重計算：
單位的定義：37℃每 g 組織每分鐘產生 1μg 還原糖定義為一個酶活性單位。
B-AI 活性（μg/min/g 鮮重）＝[(ΔA +0.001) ÷0.0016×V1]÷(W ×V1÷V2) ÷T =20.8×(ΔA +0.001)
÷W
V1：加入反應體系中樣本體積，0.2mL；V2：加入提取液體積，1mL；T：反應時間，30min；
Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本鮮重，g。
