1949年至1960年這一段時間可以稱為冷凍保存的“甘油時期”，這一時期對生物材料的冷凍保存一般都是以甘油作為保護劑。1959年Lovelock等人發(fā)現(xiàn)了一種新的化學保護劑，這就是人們熟悉的二甲基亞砜。

    按添加保護劑后的凍存液在冷凍后是否形成冰晶，凍存方法可分為非玻璃化和玻璃化凍存兩種：非玻璃化凍存是利用各種溫級的冰箱分階段降溫至-80~-70℃，然后投入液氮進行保存。該種方法凍結(jié)的細胞懸液或多或少都有冰晶的形成；玻璃化凍存則是指利用多種高濃度的冷凍保護劑聯(lián)合形成的玻璃化冷凍保護劑保護懸液細胞，直接投入液氮進行保存的方法。以該種方法凍結(jié)的細胞懸液沒有冰晶的形成。玻璃化凍存對細胞活性的保存具有較好的效果，不需要復雜的儀器設備，具有液氮儲存設備即可使用。目前，該方法已在胚胎冷凍方面得到廣泛應用，但很少應用于一般細胞的凍存。這可能與需要配制較復雜的凍存液以及冷凍前和復蘇后較繁瑣的操作有關。

    目前，無論是冷凍保存理論、各種保護劑、冷凍用品和設備以及各種生物材料的保存與復蘇技術都已十分成熟和完備。

1)細胞復蘇時半量換液法的應用

    細胞復蘇的原則為快速解凍，避免冰晶重新結(jié)晶對細胞造成傷害，導致細胞死亡。解凍后是否立即去除冷凍保護劑，依細胞種類而異，一般而言大都不需要立即去除冷凍保護劑。若要立即去除，則向解凍的細胞懸浮液加入含有5~10 mL培養(yǎng)基，離心l 000 r/min,5 min,移去上清液，加入新鮮培養(yǎng)基，混合均勻，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。若不需立即去除冷凍保存劑，則在解凍培養(yǎng)后第2天更換培養(yǎng)基，以清除殘留的冷凍保護劑等對細胞的影響。

    對于一些嬌氣的細胞，生長比較慢，它們自身會分泌一些生長因子，如果換液使用全 量的話，會驟然改變細胞的生存環(huán)境，細胞可能因為不能適應新的環(huán)境而導致生長發(fā)育滯緩，甚至死亡。這樣對細胞的生存和增殖都不利，甚至可能改變細胞的一些生物學性狀：所以，換液時使用半量換法，當?shù)诙螕Q液的時候，就可以全量換了。對于普通的腫瘤細胞，一般是換全液的，特殊情況特殊對待。

2)普通冰箱短期保存細胞的方法研究

    細胞培養(yǎng)技術是生物醫(yī)學研究中廣泛使用的實驗手段，細胞凍存又是細胞培養(yǎng)技術中的一個重要環(huán)節(jié)。

液氮凍存細胞是長期保存細胞的傳統(tǒng)方式，但實際應用中該方法有幾個不便：

①液氮罐通常是實驗室的緊張資源，而且需要經(jīng)常填充液氮。研究工作經(jīng)常會出現(xiàn)研究人員時間變動、實驗試劑購買等待和研究預料外結(jié)果出現(xiàn)等，一旦疏忽未及時補充，導致研究進展受阻，損失不可彌補，對實驗造成嚴重的不良影響。

②使用液氮的便利條件不同。除了大的科研單位、院校實現(xiàn)了液氮采購的專門負責人，規(guī)模小的單位則需要科研人員自己購置。

③液氮保存細胞的成本高。所以一般的細胞研究工作需要低成本方便的保存手段。

    利用普通冰箱短期凍存培養(yǎng)細胞是一種方法。有研究資料證明，將對數(shù)期生長的貼壁細胞，在生長90％融合時換液，第二天棄去全部液體，加入相近培養(yǎng)液體積的細胞凍存液(含10％二甲基亞砜的細胞培養(yǎng)劑)，然后parafilm膜封口，先于冰箱中4℃下放置30 min,然后轉(zhuǎn)入-20℃凍存。細胞每過一個月同時復蘇兩瓶細胞，一瓶培養(yǎng)，一瓶進行細胞存活檢查。凍存一個月的細胞存活率可達20％，而凍存2個月的細胞存活率不足10％。

    這種操作方式在細胞凍存時，不需要*消化和離心操作，節(jié)約資源，在簡陋的條件下，為研究工作提供非常有益的幫助。當然，這種方法也存在著局限，復蘇時間與凍存時間成正比，凍存時間不能太長。

    也有利用-70℃低溫冰箱對細胞進行長期保存研究資料，在長達8個月的保存時間內(nèi)，復蘇細胞，細胞與液氮保存細胞復蘇效果相同。