顯色

取出SDS-聚丙烯酰胺凝膠，經超純水清洗2次，每次1分鐘，4塊膠分別按4種不同的染色方法顯色。下列每步操作皆在搖床上進行。細胞

4種染色法成份組成及操作如下： ①傳統考馬斯亮藍染色法：清洗后的凝膠經固定液(45.4%甲醇、4.6%乙酸)固定1小時，隨后用染色液(45.4%甲醇、4.6%乙酸、0.1% CBB G250)著色過夜，再經洗脫液(5%甲醇、7.5%乙酸)過夜脫色至背景清晰。

②膠體考馬斯亮藍染色法(colloidal Coomassie brilliant blue，cCBB)染色法：凝膠先經超純水漂洗后，再用colloidal Coomassie blue G250染色液(1.6%磷酸、8%硫酸銨、0.02% CBB G250、20%乙醇)著色過夜，洗脫液為超純水，換液3～4次直至背景清晰。

③改良考馬斯亮藍染色法(modified Coomassie brilliant blue，mCBB)染色法[6];操作方法同膠體考馬斯亮藍染色法，只是染色液組成不同(0.12% CBB G250、10%硫酸銨、10%磷酸、20%乙醇)，著色1小時即可。

④銀染(silver staining)：凝膠漂洗后先被固定液(50%甲醇+ 5%乙酸)固定1小時，隨后分別用50%甲醇和超純水清洗各10分鐘，0.02 mg/L Na2S2O3 致敏1分鐘，超純水清洗2次，每次1分鐘，再用預冷的0.15% AgNO3著色20分鐘，超純水再次清洗2次，每次1分鐘，2% Na2CO3 + 0.04% 甲醛顯色20～30秒，當溶液變黃以后除去，換新鮮的溶液后繼續顯色直至顯色適度后，以5%乙酸終止顯色。

成像、分析、質譜鑒定

脫色后，凝膠經GS-800 Calibrated Densitometer掃描成像，用PDQuest軟件進行分析。切取蛋白質點，*消化，行質譜鑒定。

結果

4種染色法的蛋白質檢測靈敏性分析

β-半乳糖苷酶的上樣量依次分別為1、0.24、0.062、0.0156和0.004μg。經傳統考馬斯亮藍染色后的條帶在62ng水平隱隱可見;而膠體考馬斯亮藍染色法的靈敏度稍高，62ng條帶明顯可見;改良考馬斯亮藍染色法的效果更好些，在15.6ng水平可見條帶的顯示;而銀染法靈敏度zui高，在15.6ng水平可見清晰條帶的顯現，同時在4ng可見隱約條帶。4種染色法的比較顯示，靈敏度zui高的是銀染法，可達納克級水平，其次為改良考馬斯亮藍染色法，10納克級蛋白質能被檢測。而膠體考馬斯亮藍染色法和經典考馬斯亮藍染色法稍差，檢測水平僅達幾十納克。

4種染色法的雙向電泳蛋白質點顯示比較

來自NB4細胞的全蛋白經pH 3-10NL的等電點梯度分離，SDS-PAGE 二維垂直電泳后被3種考染法著色成像的顯示可以看出傳統考馬斯亮藍染色法的蛋白質點顯現zui少，膠體考馬斯亮藍染色法的蛋白質點顯現較多，而改良考馬斯亮藍染色法的蛋白質點顯現更多。凝膠背景以后二者為更清晰。經PDQuest軟件進行分析，3幅圖的蛋白質點顯現數分別為483、679、890。NB4細胞的全蛋白經pH 5-8 IPG分離，分別經改良考馬斯亮藍染色法與銀染法著色成像的蛋白點顯示，二者上樣量一致，蛋白點的顯現數量相當，但銀染的蛋白點明顯顯示著色重。這與單向電泳的效果相同。細胞

4種染色法的可操作性比較

在比較其蛋白質檢測靈敏性的同時，對染色法的操作簡便性、安全性以及蛋白質經質譜鑒定的成功率也作了對比。比較顯示，考馬斯亮藍染方法簡便，但耗時較長，經改進后可以做到無毒操作，質譜兼容性較高。銀染步驟繁多，但耗時短;操作過程中有甲醇、甲醛等毒性物的接觸，質譜兼容性低。即使我們選擇的銀染法被文獻報道為質譜兼容的，但仍然表現為低的蛋白鑒定率，不及考馬斯亮藍染。