這是一個逐步平衡的過程，因此需經擴散才能達到反應的終點。在其后加入的酶標記抗體與固相抗原的結合也同樣如此。這就是為什么ELISA檢測試劑盒反應總是需要一定時間的溫育。
   保溫的方法除有的ELISA儀器附有特制的電熱塊外，一般均采用水浴，可將ELISA試劑盒板置于水浴箱中，ELISA板底應貼著水面，使溫度迅速平衡。為避免蒸發，板上應加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，此時可讓反應板漂浮在水面上。
   若用保溫箱，ELISA檢測試劑盒應放在濕盒內，濕盒要選用傳熱性良好的材料如金屬等，在盒底墊濕的紗布，zui后將ELISA試劑盒板放在濕紗布上。濕盒應先放在保溫箱中預溫至規定的溫度，特別是在氣溫較低的時候更應如此。無論是水浴還是濕盒溫育，反應板均不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。室溫溫育的反應，操作時的室溫應嚴格限制在規定的范圍內，標準室溫溫度是指20～25℃，但具體操作時可根據說明書的要求控制溫育。室溫溫育時，ELISA檢測試劑盒只要平置于操作臺上即可。應注意溫育的溫度和時間應按規定力求準確。為保證這一點，在一個人操作的情況下，一次不宜多于兩塊板同時測定。