植物染色質(zhì)免疫沉淀分析（CHIP）試劑盒 產(chǎn)品說明書

【資料簡介】

植物染色質(zhì)免疫沉淀分析（CHIP）試劑盒
產(chǎn)品說明書
主要用途
植物染色質(zhì)免疫沉淀分析（CHIP）試劑是一種旨在通過甲醛交聯(lián)、物理或化學(xué)處理細(xì)胞核
以及染色質(zhì)，從而運(yùn)用特異抗體結(jié)合免疫沉淀，然后萃取DNA，擴(kuò)增分析，來確定結(jié)合蛋
白的目標(biāo)DNA 序列的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)由大師級科學(xué)家精心研制、成功實驗
證明的。其適用于DNA 復(fù)制、重組、修復(fù)、轉(zhuǎn)錄、病毒組裝中的DNA 和蛋白質(zhì)（包括轉(zhuǎn)
錄因子、聚合酶、組蛋白等）的相互作用的研究。廣泛應(yīng)用于定性檢測各種植物組織（花瓣、
葉片、種子等）DNA 蛋白結(jié)合序列和定量檢測序列特異性DNA 結(jié)合蛋白（例如轉(zhuǎn)錄因子）
及其突變形成等。產(chǎn)品即到即用，性能穩(wěn)定，操作便捷，反應(yīng)敏感，結(jié)合顯著，重復(fù)性好。
技術(shù)背景
DNA 和蛋白質(zhì)的相互作用是調(diào)控細(xì)胞反應(yīng)過程的要素之一。染色質(zhì)免疫沉淀分析方法
（chromatin immunoprecipitation；CHIP）是研究活體內(nèi)（in vivo）DNA 和蛋白質(zhì)的相互作
用的zui有力的工具：用于分析染色質(zhì)結(jié)構(gòu)動力學(xué)、轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)、以及表觀遺傳學(xué)變異
等。CHIP 技術(shù)通過三大步驟實現(xiàn)：*，甲醛固定后染色質(zhì)分離和斷片；第二，運(yùn)用特異
蛋白之抗體，免疫共沉淀結(jié)合蛋白（包括轉(zhuǎn)錄因子、聚合酶、組蛋白等）的染色質(zhì)片斷；第
三，分析目標(biāo)DNA 和蛋白的修飾。其中轉(zhuǎn)錄因子作為調(diào)節(jié)蛋白，通過結(jié)合核DNA，以達(dá)
到控制基因表達(dá)。
產(chǎn)品內(nèi)容
清理液（Reagent A） 毫升
固著液（Reagent B） 毫升
終止液（Reagent C） 毫升
裂解液A（Reagent D） 毫升
裂解液B（Reagent E） 毫升
裂解液C（Reagent F） 毫升
核溶液（Reagent G） 毫升
稀釋液（Reagent H） 毫升
結(jié)合液（Reagent I） 毫升
低鹽液（Reagent J） 毫升
高鹽液（Reagent K） 毫升
平衡液（Reagent L） 毫升
緩沖液（Reagent M） 毫升
洗脫液（Reagent N） 毫升
解聯(lián)液（Reagent O） 毫升
酶解液（Reagent P） 微升
萃取液（Reagent Q） 毫升
濃縮液（Reagent R） 毫升
沉淀液（Reagent S） 毫升
凈化液（Reagent T） 毫升
擴(kuò)增液（Reagent U） 微升
補(bǔ)充液（Reagent V） 毫升
說明書1 份
保存方式
保存裂解液A（Reagent D）、裂解液B（Reagent E）、裂解液C（Reagent F）、核溶液（Reagent
G）、稀釋液（Reagent H）、結(jié)合液（Reagent I）、解聯(lián)液（Reagent O）、酶解液（Reagent P）、
萃取液（Reagent Q）、濃縮液（Reagent R）和擴(kuò)增液（Reagent U）在－20℃冰箱里，其余
的保存在4℃冰箱里； 有效保證6 月
用戶自備
特異抗體：用于目標(biāo)蛋白的結(jié)合
特異引物：用于目標(biāo)DNA 的擴(kuò)增或測序
1.5 毫升離心管：用于樣品反應(yīng)操作和保存的容器
2 毫升離心管：用于樣品反應(yīng)操作和保存的容器
15 毫升錐形離心管：用于樣品處理的容器
50 毫升錐形離心管：用于植物組織處理的容器
恒溫水槽：用于孵育反應(yīng)物
震蕩器：用于混勻反應(yīng)物
4℃微型臺式離心機(jī)：用于沉淀樣品
4℃臺式離心機(jī)：用于沉淀樣品
平式搖蕩儀或搖床：用于孵育和混勻反應(yīng)
DOUNCE 勻漿器：用于裂解植物組織細(xì)胞
超聲儀：用于裂解植物組織細(xì)胞核
PCR 儀：用于擴(kuò)增反應(yīng)
電泳儀：用于檢測擴(kuò)增產(chǎn)物
實驗步驟
實驗開始前，準(zhǔn)備好待測植物的預(yù)處理：藥物處理等。同時將－20℃保存的試劑置于冰槽里
融化。然后進(jìn)行下列操作。
一、植物組織細(xì)胞核分離
1． 準(zhǔn)備好新鮮處理的植物組織（花瓣、葉片、種子等），并秤重1 克組織重量
2． （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的50 毫升錐形離心管
3． （選擇步驟）加入毫升清理液（Reagent A）清洗1 次
4． 即刻用刀片切碎組織
5． 或置于液氮管過夜，次日取出后，即刻（zui快速度）碾碎組織成粉末（注意：切莫使組
織凍融）
6． 放進(jìn)15 毫升錐形離心管
7． 加入毫升室溫預(yù)熱的固著液（Reagent B）
8． 平放置于搖床，室溫下（25℃）孵育15 分鐘，速度為100RPM
9． 加入微升室溫預(yù)熱的終止液（Reagent C）
10．繼續(xù)平放置于搖床，室溫下（25℃）孵育5 分鐘，速度為100RPM
11．放進(jìn)臺式離心機(jī)離心5 分鐘，速度為1000g
12．小心抽去上清液
13．加入毫升預(yù)冷的清理液（Reagent A），混勻
14．放進(jìn)4℃臺式離心機(jī)離心5 分鐘，速度為1000g
15．小心抽去上清液
16．重復(fù)實驗步驟13 至15 二次
17．加入毫升預(yù)冷的裂解液A（Reagent D），混勻
18．渦旋震蕩5 秒，充分混勻
19．置于冰槽里孵育10 分鐘
20．即刻放入預(yù)冷的DOUNCE 勻漿器
21．在冰槽里用研磨棒勻化組織（約80 下）（注意：參見注意事項6）
22．（選擇步驟）準(zhǔn)備1 個小型漏斗，內(nèi)襯尼龍絲，置于15 毫升錐形離心管上
23．（選擇步驟）將所有組織勻漿物移入到小型漏斗里過濾
24．將所有組織勻漿物移入15 毫升錐形離心管
25．放進(jìn)4℃臺式離心機(jī)離心20 分鐘，速度為2000g
26．小心抽去上清液
27．加入毫升裂解液B（Reagent E），混勻顆粒群
28．轉(zhuǎn)移到1.5 毫升離心管
29．放進(jìn)4℃微型臺式離心機(jī)離心10 分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如EPPENDORF
5415）
30．小心抽去上清液
31．加入微升裂解液C（Reagent F），混勻顆粒群
32．準(zhǔn)備1 個新的1.5 毫升離心管
33．加入微升裂解液C（Reagent F）
34．小心加入微升上述樣品懸液在裂解液C（Reagent F）的上面
35．放進(jìn)4℃微型臺式離心機(jī)離心60 分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如EPPENDORF
5415）
36．小心抽去上清液
37．加入毫升核溶液（Reagent G），混勻顆粒群
38．置于冰槽里孵育10 分鐘
39．置于200 瓦超聲儀下，功率50％，猝擊20 秒，間隙10 秒冷卻，重復(fù)3 次（注意：根
據(jù)DNA 段大小，增加超聲次數(shù)）
40．放進(jìn)4℃微型臺式離心機(jī)離心10 分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如EPPENDORF
5415）
41．小心移取上清液分裝到10 個2 毫升離心管（100 微升/管）
42．其中： 1）選擇1 管進(jìn)行1：50 稀釋后，測定OD260，確定DNA 含量，使所有樣品的
檢測濃度調(diào)整一致（注意：建議OD260＝0.1 為佳）
2）或選擇1 管進(jìn)行蛋白濃度檢測，使所有樣品的檢測濃度調(diào)整一致（注意：蛋白總量1 至
5 毫克為佳；
3）或選擇1 管進(jìn)行去交聯(lián)以及電泳鑒定超聲處理的DNA 段（0.3 至1.5kb）（注意：參見
注意事項7）
43．選擇1 管繼續(xù)后續(xù)操作，其余的保存在－70℃冰箱里
44．加入微升稀釋液（Reagent H）
二、結(jié)合反應(yīng)
1． 加入微升結(jié)合液（Reagent I）
2． 平放置于4℃搖床孵育1 小時，速度為100RPM
3． 放進(jìn)4℃微型臺式離心機(jī)離心1 分鐘，速度為400g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
4． 小心移取上清液到2 個新的2 毫升離心管（每管500 微升：1 管為無抗體對照；1 管為
抗體處理管）
5． 加入50 微升用戶自備的特異抗體（總量為5 微克）到抗體處理管
6． 將對照和抗體管平放置于4℃搖床孵育16 小時，速度為100RPM
7． 加入微升結(jié)合液（Reagent I）到抗體處理管
8． 將對照和抗體管平放置于4℃搖床孵育2 小時，速度為100RPM
9．將抗體管放進(jìn)4℃微型臺式離心機(jī)離心1 分鐘，速度為400g（或2000RPM，例如eppendorf
5415）
10．小心抽去上清液
11．加入毫升低鹽液（Reagent J）到抗體管，混勻
12．平放置于4℃搖床孵育5 分鐘，速度為100RPM
13．放進(jìn)4℃微型臺式離心機(jī)離心1 分鐘，速度為400g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
14．小心抽去上清液
15．加入毫升高鹽液（Reagent K）到抗體管，混勻
16．平放置于4℃搖床孵育5 分鐘，速度為100RPM
17．放進(jìn)4℃微型臺式離心機(jī)離心1 分鐘，速度為400g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
18．小心抽去上清液
19．加入毫升平衡液（Reagent L）到抗體管，混勻
20．平放置于4℃搖床孵育5 分鐘，速度為100RPM
21．放進(jìn)4℃微型臺式離心機(jī)離心1 分鐘，速度為400g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
22．小心抽去上清液
23．加入毫升緩沖液（Reagent M）到抗體管，混勻
24．平放置于4℃搖床孵育5 分鐘，速度為100RPM
25．放進(jìn)4℃微型臺式離心機(jī)離心1 分鐘，速度為400g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
26．小心抽去上清液
27．重復(fù)實驗步驟23 至26 一次
28．加入微升洗脫液（Reagent N）到抗體管，混勻
29．平放置于搖床，室溫下孵育15 分鐘，速度為100RPM
30．放進(jìn)4℃微型臺式離心機(jī)離心3 分鐘，速度為400g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
31．小心移取上清液到新的2 毫升離心管
32．重復(fù)實驗步驟28 至31 一次
33．小心移取上清液合并到上述2 毫升離心管（注意：可以暫時停止，存放在－20℃，次日
繼續(xù)）
三、DNA 萃取
1． 分別加入微升解聯(lián)液（Reagent O）到抗體處理管和無抗體對照管，混勻
2． 置于65℃恒溫水槽孵育2 小時
3． 分別加入微升酶解液（Reagent P）
4． 置于55℃恒溫水槽孵育2 小時
5． 室溫下靜置15 分鐘
6． 分別加入微升萃取液（Reagent Q）（注意：使用前搖勻）
7． 渦旋震蕩15 秒
8． 放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心5 分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
9． 分別移出450 微升上層液相溶液到2 個新的2 毫升離心管（注意：切莫觸碰液相交界面
上的白色膜狀物）
10．分別加入微升濃縮液（Reagent R）到新的離心管
11．分別加入毫升沉淀液（Reagent S）
12．渦旋震蕩15 秒
13．放進(jìn)微型臺式微型離心機(jī)離心15 分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf
5415）（注意：離心前做好方位標(biāo)記，以便離心后觀察管底沉淀顆粒）
14．小心抽掉上清液
15．分別加入毫升凈化液（Reagent T）
16．放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心5 分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
17．小心抽掉上清液
18．空氣中晾干沉淀顆粒群
19．分別加入微升緩沖液（Reagent M）
20．溶解后放進(jìn)－20℃冰箱保存
四、PCR 擴(kuò)增
1． 將擴(kuò)增液（Reagent U）和補(bǔ)充液（Reagent V）從－20℃冰箱里取出
2． 置入冰槽里直至融化
3． 針對一個樣本，每次移出微升擴(kuò)增液（Reagent U）到PCR 管
4． 加入2 微升上述結(jié)合實驗中獲得的DNA 樣品（總量100 納克）
5． 分別加入1 微升用戶自備的特異性的引物F 和引物R（各350 納克或25 微摩爾）
6． 再加入微升補(bǔ)充液（Reagent V）（反應(yīng)總量為25 微升）
7．即刻放進(jìn)微型臺式離心機(jī)瞬時離心5 秒，速度為500g（或2000RPM；例如eppendorf 5415）
8． 加入50 微升PCR 級礦物油（注意：參見注意事項9）
9． 即刻進(jìn)行熱啟動PCR 反應(yīng)：
溫度（℃） 時間循環(huán)
95 2 分鐘1
95
Tm
72
30 秒
1 分鐘
30 秒
35
72 5 分鐘1
10．反應(yīng)完畢后，移取5 微升進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳
11．如果進(jìn)行測序鑒定，膠回收PCR 產(chǎn)物（建議使用高質(zhì)純化一步法膠回收試劑盒；
12．分別移出2 微升反應(yīng)液到2 個不同的新的1.5 毫升離心管（每微升100 納克）
13．加入1 微升用戶自備的特異性巢式引物F（每微升350 納克）到其中一個1.5 毫升離心
管，作好標(biāo)記
14．加入1 微升用戶自備的特異性巢式引物R（每微升350 納克）到另一個1.5 毫升離心管，
作好標(biāo)記
15．進(jìn)行后續(xù)的直接測序反應(yīng)
注意事項
1． 本產(chǎn)品為10 次（1 克植物組織樣本）操作
2． 操作時，須戴手套
3． 固著處理必須在室溫下進(jìn)行，其余的操作均須在4℃狀態(tài)進(jìn)行
4． 嚴(yán)格按照操作規(guī)程進(jìn)行
5． 建議使用無抗體對照
6． 通常勻化次數(shù)為80 下達(dá)到80％的組織細(xì)胞裂解為理想狀態(tài)，但不同的組織類型會存在
差異。用戶可以通過顯微鏡觀察3 微升勻漿物的組織細(xì)胞裂解程度：完整細(xì)胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓
環(huán)。低于50％可以增加勻化次數(shù)
7． 通常超聲處理后的DNA 段大小為0.3 至1.5kb；如果使片段小于1.0kb，增加超聲次
數(shù)或功率即可。電泳鑒定前，加入10 微升解聯(lián)液（Reagent O）到1 管100 微升超聲處理后
樣品，65℃孵育4 小時，移取20 微升進(jìn)行1.0％瓊脂糖凝膠電泳。其標(biāo)準(zhǔn)片段電泳圖象如下：
泳道1 為DNA 標(biāo)準(zhǔn)樣；泳道2 為未經(jīng)超聲處理樣品；泳道3 為超聲處理后樣品；泳道4 為
強(qiáng)化超聲處理后樣品
8． 根據(jù)用戶PCR 儀的性能，決定是否加入礦物油（Mineral Oil）
9． 建議使用軟件測算Tm 溫度；參考公式為Tm=4（G+C）+2（A+T）
10．在－20℃冰箱里儲存的產(chǎn)品避免反復(fù)凍融
11．本公司提供系列CHIP 分析試劑產(chǎn)品
質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定不含污染性蛋白酶和核酶