PCR產物的直接測序

【資料簡介】

 

PCR產物的直接測序

1.凝膠純化PCR擴增的靶序列

如果*PCR反應條件不能產生所需的特異性產物，可采用新的寡核苷酸重新進行擴增，或用凝膠電泳來分離不同的PCR產物，而后再各自重新擴增進行序列分析。長度不同的片段可以用瓊脂糖凝膠電泳來分離:

1.片段大小在80-100bp時，可采用3%NuSieve1%普通瓊脂糖或用聚丙烯酰胺膠來分離。

2.從膠上切下含所南非PCR片段的薄片。

3.加入50∽100μlTE浸泡膠片，可反復凍融或放置幾個小時使DNA從膠中擴散出來。

4.取少量（1-5%）進行第二次擴增，為得到純凈單一的產物，用于第二次PCR擴增 的凝膠抽提物的量必須少于1ng。

5.現已發現瓊脂糖含有抑制Tab聚合酶活的物質。因而，如需重新擴增供Tab聚合 酶測序用的片段，用丙烯酰胺電泳分離。

當用PCR引物擴增幾個同樣長度的相關序列時，如來自幾個新近復制的基因，或重復序列或保守的信號序列（conserved signal sequences）的同樣顯子，可以通過下列兩種不同方法來改進電泳分離。

1）.先用只切割某一模板的內切酶進行酶切，而后電泳純化完整的PCR產物。

2）.用可使核苷酸序列不同的擴增產物分開的電泳系統。下一個部份將討論此類系統中的變性甲酰胺梯度凝膠系統。采用方法一時，必須事先了解在不同PCR產物中的內切酶位點。

 

2.雜合體的直接測序
當兩個等位基因由于單一位點突變而產生差異時，用一個PCR引物直接進行測序，能找出雜合位點。但是，帶有幾個點突變或短片段的插入/缺失的等位模板用PC R引物之一來直接測序，將產生復合序列帶（compound sequencing ladders）。

有四種方法可以確定幾種點突在型并從雜合體中獲得單個等位基因的序列:

1）.克隆分離不同 的模板

2）.在測序之前，利用模板之間核苷酸序列的差異，用電泳技術分離不同的模板

3）.在測序反應中只啟動一個等位基因

4）.只擴增一個等位基因

3.測序模板的制備

與PCR產物的直接測序有關的一些問題是變性后由于擴增片段的兩條鏈可以迅速結合起來，從而阻止了測序引物與它的互補序列退火，或阻止了引物──模板復合物的延伸。在測序反應中，模板鏈重新結合使一小部份模析驂與測序從而弱化zui終的測序條帶。為減少此問題，可用改進的標準雙鏈DNA測序法或用PCR制備單鏈模板。
.雙鏈DNA模板

有兩種不同方法用來制備測序用的模板，目前都已用來測定共價閉環雙鏈質粒模板的序列。用這些方法來進行PCR產物的測序通常是較困騅的，因為短的線性模板比團環質粒的雙鏈更易于重新結合。在這兩種方法中，PCR片段可以由凝膠電膠或在電泳前*行旋轉透析（Spin-dialysis）純化。

1.在室溫下，模板先在0.2M NaOH中變性5分鐘，冰凍，加入0.4倍的5M醋酸銨 （pH7.5）來中和反應。立即用四體積的無水乙醇沉淀DNA。在合適的退火溫度下，加入測序緩沖引物。

2.在95℃下保溫5分鐘來變性模板，冰浴（或在干冰乙醇中）快速冷卻離心管，以減少鏈的重新結合。加入測序引物并使反應達到合適的溫度。測序引物在變性前或后加入都合適。
單鏈DNA模板

使用單鏈模板可以避免測序中鏈的重新結合。單鏈模板可以從雙鏈DNA模板經鏈分離凝膠中制備，或用PCR反應制備。大于500bp的單鏈DNA片段，可從瓊脂糖凝膠中分離笪到，但它不適合于更短的單鏈。制備單鏈DNA的另一種不同方法是在PCR反應中使用一個*標記的引物，變性后的PCR產物經過一個親合素柱而使兩條鏈得到分離，只有*標記的鏈才可結合到柱上。

然而，zui簡單的方法是用改進的PCR方法，用此方法制備既定的單鏈DNA。在這個反應中（不對稱PCR，asymmetric PCR），在開始的20-25個循環中，兩個比率不對稱的擴增引物產生出雙鏈DNA，當*的那個引物耗光后，隨后的5-10個循環就產生出ssDNA。單鏈DNA在約在25個循環后開始出現，這時*的引物也幾乎耗盡。經過一個短暫快速上升后，ssDNA就開始如預期的那樣呈線性積累，這時反應中僅有一個引物存在。各種比率的引物都以這種形式產生 ssDNA。一般對100μlPCR反應體系而言，引物比率為50pmo:0.5pmol，經過30個循環后，大約可產生1-3pmol的ssDNA。

ssDNA的產量可用下列幾種方法來估計:a）。在PCR 反應中，除了加入正常數量的dDNA外，還加入32P-dNTP。取10%的反應產物在薄的3% NuSieve+1%普通瓊脂糖凝膠中電泳，干燥并與膠片一起曝光。b）.取5%的反應物來走 膠，轉移到膜上，并用與ssDNA互補的寡核苷酸為探針雜交。ssDNA不能用EB染色來定 量，因為ssDNA有形成二級結構的趨勢且染料的插入在模板中是隨機的。使用不對稱引物比例的擴增效率比兩種引物均過量80-90%）的擴增效率低（70%）。

在實驗中，這可通過增加PCR循環的次數來彌補。若不對稱的PCR反應不能產生足夠數量的ssDNA，可以試一試不同的引物比率;b）.再加5-10個PCR循環;c）.在zui后五個循環中多加Tab聚合酶（2U）;d）.試一下相反的不對稱引物比率。有時，相反的不對稱引物比率可能給出不同產量的ssDNA。制備出的單鏈DNA用*的那個PCR引物或用一個內引物來測序，并應用常規方法進行摻入測序（incorporation sequencing）或標記引物測序。制備出的 ssDNA鏈可能有一個不連續的5-末端，但可能在靠近3-末端不同位點處被切去，這是由于延伸過程中終止過早所產生的。然而，對于測序反應中所使用的任何一種引物，只有完整的ssDNA可以用作測序模板。

zui近還報道了另一種方法制備單鏈核酸模板進行直接測序。這種方法包括在一個 PCR引物上加入噬菌體的啟動子，轉錄出該PCR產物的RNA拷貝，再用反轉錄酶不測序。但由于擴增反應后附加了一個酶促反應步驟和限于用反轉錄酶作為測序酶，這種方法的應用受到很大的限制。
4.用不耐熱DNA聚合酶進行PCR產物的測序

一些不耐熱DNA聚合酶已經用來直接測序體外擴增的DNA。使用Klenow聚合酶，修飾T7DNA聚合酶（測序酶）及反轉錄酶來測序。

用Taq聚合酶進行PCR產物的測序