動物外周血淋巴細胞分離液實驗方法

【資料簡介】

“XXXX”動物外周血淋巴細胞分離液實驗方法

技術文檔編號：TBD0017SOP

【產品規格】

200ml/Kit

【產品組成】

為方便廣大用戶使用，試劑內容如下：

	名稱	產品編號	規格
A	XXXX 動物外周血淋巴細胞分離液		200ml
B	樣本稀釋液（贈品）	2010C1119	200ml
C	清洗液（贈品）	2010X1118	200ml
D	說明書		1 份

【實驗前準備】

1. 適用儀器

最大離心力可達 1200g 的水平轉子離心機

2. 抗凝劑的選擇

在動物實驗采血時，很多實驗者選擇醫用真空獲得抗凝血，醫用中的抗凝 劑只考慮血漿質量，但不利于高純度細胞分離實驗。

為此，別開發出抗凝劑及抗凝管專用于細胞分離，改變使用普通 獲得抗凝血分離效果不佳，提取率及純度低下的不良結果。

3. PBMC 高效離心管（詳見 PBMC 高效離心管使用說明）

序號	產品名稱	產品貨號	規格
1	PBMC 高效離心管	601001	50ml
2	PBMC 高效離心管（隨試劑盒附贈 5 支）	601002	15ml

【檢驗方法】

全過程樣本、試劑及實驗環境均需在 20±2℃的條件下進行。

首先取抗凝血按體積比 1:1 的比例與樣本稀釋液（產品編號：2010C1119）混勻，根據稀釋后的樣本量大小，分以下兩種情況：

情況 A：稀釋后的血液樣本量小于 5ml 時，實驗方法如下：

1. 取一支 15ml 離心管，先加入與稀釋后樣本等量的分離液（注：分離液最少不得少于 3ml）。

2. 用吸管小心吸取稀釋后的血液樣本加于分離液液面上，400-500g，離心 20-30min（注： 根據血液樣本量確定離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，離心時間越長，具體離 心條件需客戶自行摸索，以達到分離效果）。

3. 離心后，此時離心管中由上至下分為四層。層為血漿層。第二層為環狀乳白色淋巴 細胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細胞層。

4. 用吸管小心吸取第二層環狀乳白色淋巴細胞層到另一 15ml 離心管中，往所得離心管中加入 10ml 清洗液（產品編號：2010X1118），混勻細胞。

5. 250g，離心 10min。

6. 棄上清。

7. 用吸管以 5ml 清洗液（產品編號：2010X1118）重懸所得細胞。

8. 250g，離心 10min。

9. 重復 6、7、8，棄上清后以 0.5ml 后續實驗所需相應液體重懸細胞。

情況 B：稀釋后的血液樣本量大于等于 5ml 時，實驗方法如下：

1. 取一支適當的離心管，先加入與稀釋后樣本等量的分離液。

2. 將經稀釋后的血液樣本小心加于分離液之液面上，550-650g（最大離心力可至 1000g）， 離心  20-30min。（注：根據血液樣本量確定離心條件，血液量越多，離心力越大，離心時間越長，具體離心條件需客戶自行摸索，以達到分離效果。加入血液樣本后，樣  本及分離液總體積不得超過離心管總體積的三分之二）。

3. 剩余步驟同“情況 A”中步驟 3 至步驟 9。分離圖例

【注意事項】

1. 全過程樣本、試劑及實驗環境均需在 20±2℃的條件下進行。為獲得的實驗結果，最好在取血 2h 內進行實驗，血液存放時間越長，細胞分離效果越差。血液放置超過 6h 后分離效果更差甚至不能達到分離目的。

2. 本實驗不要使用高聚合材質（如聚苯乙烯）的塑料制品，應使用無靜電、低靜電離 心管及未經堿處理過后的玻璃制品，因為靜電作用將導致細胞貼壁、堿處理的玻璃表面 會變成毛面，影響細胞分離效果。

3. 吸取過多的淋巴細胞層及分離液層會導致分離液交界處的粒細胞被吸出從而使混雜的粒 細胞數量增加。

4. 吸取過多的淋巴細胞層上層溶液會導致血漿蛋白及血小板混雜。

【儲存條件及有效期】

常溫保存，有效期 2 年。本品易感染細菌，需無菌條件操作。無菌條件下操作，啟封后置常溫保存。如 4℃保存，本分離液易出現白色結晶，影響分離效果。

【參考值（參考范圍）】

本實驗淋巴細胞提取率及純度均大于 80%。

下表為成年人外周血中各種細胞的數量及比例，用戶可適當進行參考。

 

	紅細胞	白細胞	血小板
含量（個/L）	（4.0-5.5）×1012	（4.0-10.0）×109	（1.0-3.0）×1011

 

		中性粒細胞	淋巴細胞	單核細胞
		50%-70%	20%-40%	3%-8%

【相關實驗技術方案】

1. 所獲得淋巴細胞的培養技術。

2. 所獲得淋巴細胞的核酸提取技術。

3. 所獲得淋巴細胞的鑒定方法

A. 流式細胞技術

B. 免疫組化技術

C. 原位雜交技術

D. PCR 技術

【可能存在的問題及解決方法】

1. 由于血液粘度、細胞密度等差異可能造成的問題及解決方案如下表所示：

 

出現情況	出現原因	建議解決方案
離心后目的細胞存在于血漿層或稀釋液層	轉速過小或離心時間過短	適當增減轉速
離心后目的細胞存在于分離液中	轉速過大或離心時間過長
離心后白環層彌散	細胞密度過大	調整細胞密度
離心后白環層太淺或看不見	細胞密度過小

2. 本分離液分離細胞的原理為密度梯度離心，其密度與溫度、大氣壓等密切相關。不同地 區客戶可根據當地情況對離心條件進行適當調整。建議對離心條件進行調整時，恒定離 心時間，對離心轉速進行調整。

3. 本分離液依照國際標準，全部使用藥用級原料，性能指標與國產同類產品略有不同，可 能出現紅細胞沉降不*的情況，可以適當加大離心轉速。

注：在對離心條件進行調整時，離心轉速的加減以 50-100g 為基數，直至達到分離效果， 離心力最小不得小于 400g，最大不得大于 1200g。離心時間以 20-30min 為準。