蛋白質純化技術

【資料簡介】

一般而言，上游指基因克隆、細胞培養等目的產物表達工序，下游指從表達有目的產物的復雜的混合液中分離純化得到符合要求的目的產物的一系列步驟。美、日、歐等發達國家生物技術產品工業化的實踐證明：生物技術產品的產業化高度依賴于基因工程下游工序技術及設備的進步。
一、純化工藝常用銜接技術：
1、鹽析：常采用硫酸銨、硫酸鈉鹽析，獲得的鹽析沉淀物在低溫冰箱（<-20℃）中可以長期保存。
2、等電點沉淀：根據蛋白質、多肽在等電點時溶解度zui小的特點進行。
3、有機溶劑沉淀：采用冷的丙酮、乙醇沉淀蛋白質。例如人血漿蛋白的乙醇分級沉淀。
4、透析：根據目的蛋白質、多肽的分子量，選取適宜的透析袋進行透析，可以起到更換緩沖液以及去除一些低分子雜質的目的。
5、超濾：根據目的蛋白質、多肽的分子量，選取適宜截留分子量（MWcutoff）的超濾膜進行超濾。
6、真空冷凍干燥：利用在低溫和高真空條件下，冰不經融化為液態水而直接升華為水蒸氣的原理?？梢院芎玫貪饪s樣品和保存蛋白質、多肽的生物活性。
7、變性沉淀：根據目的蛋白質、多肽對于溫度或者酸堿性的耐受性，在較高的溫度或者較的pH條件下處理樣品，使雜質去除的方法。例如*制備中使用的熱變性（~80℃）去除雜蛋白。如果目的蛋白、多肽本身熱穩定性、酸堿穩定性不高則不宜采用。
8、離心沉淀：利用離心沉降力將不溶性顆粒物與溶液分離的技術，常采用高速冷凍離心機進行。
9、脫鹽：透析、超濾可用于進行脫鹽，Sephadex G25、G50常用于蛋白質脫鹽。
10、過濾：澄清過濾、除菌過濾（0.22微米膜過濾）、超濾（1000~300000道爾頓）
二、蛋白質、多肽液相色譜純化方法簡介
chromatography,色譜，層析
常用的液相色譜純化方法及其原理：
方法　　　　　 　　　分離原理 　　　　基于
凝膠過濾（GF） 　　分子大小/形狀　 分子形態
離子交換色譜（IEX） 分子所帶電荷 Asp、Glu、Lys、Arg、His等帶電氨基酸
疏水作用色譜（HIC） 表面疏水性 Trp、Phe、Ile、Leu、Tyr、Pro、Met、Val、Ala等疏水性氨基酸
反相色譜（RPC） 　　表面疏水性 Trp、Phe、Ile、Leu、Tyr、Pro、Met、Val、Ala等疏水性氨基酸
金屬螯合色譜（IMAC） 分子與金屬形成配位鍵 His、Trp、Cys
親和色譜 　　　　　特異生物識別作用 抗原-抗體，酶-底物，酶-抑制劑等
共價結合色譜 　　　共價結合 巰基（Cys）
1、純化的一般目標和方法
首先，自然來源或者重組表達的蛋白質經過一些粗提的步驟（例如：勻漿、離心、硫酸銨沉淀等）成為穩定的可以用于色譜分離的樣品。
然后進行捕獲色譜（capture chromatography），主要目標是濃縮和去除大量的容易去除的雜質，此步zui關心的是流速和載量，常采用高載量、快流速凝膠。
經過濃縮的部分純化的樣品進行中級色譜（intermediate chromatography），目的是去除較難去除的雜質，此步zui關心的是分辨率，常采用高分辨率的細顆粒凝膠。
zui后為了得到符合要求的zui終產品，去除殘存的雜質以及目的蛋白的多聚物或者降解片斷，進行精制色譜（polishing chromatography），常采用具有高分辨率的凝膠過濾凝膠進行凝膠過濾色譜。
2、純化前的準備工作
（1）樣品穩定性試驗
a、測定樣品在pH 2-9的穩定性；
b、測定樣品在0-4 mol/L NaCl及0-2 mol/L 硫酸銨中的穩定性；
c、測定樣品在0-50%乙醇、甲醇中的穩定性；
d、測定樣品在4-40℃的穩定性；
e、室溫下靜置過夜，測定對蛋白水解酶的穩定性。
（2）樣品預處理
a、去除樣品中顆粒物（0.45-0.22微米膜過濾或者10000 g離心15分鐘）
b、去除樣品中脂類（ 10000 g離心15分鐘或有機溶劑抽提）
c、去除樣品中核酸（加入核酸酶消化或者使核酸沉淀）
d、抑制樣品中蛋白水解酶（加入蛋白酶抑制劑、低溫下快速*步分離或在蛋白酶缺陷宿主中表達重組蛋白）
樣品中有害雜質及去除辦法：
雜質　　　　　　 害處 　　　　　　　　預防措施
顆粒物 　堵塞柱子，增大反壓力 0.45-0.22微米膜過濾；10000g離心10-15分鐘；細胞勻漿，4000-5000g離心30分鐘。
脂類　　 封閉介質配基、導致沉淀、導致非特異吸附 10000 g離心10-15分鐘；若目標分子穩定，用有機溶劑抽提
核酸　　 高粘度、封閉介質結合位點 加入核酸酶消化，或使核酸沉淀
蛋白酶　 降解目的蛋白 加入蛋白酶抑制劑；用親和色譜除去蛋白酶；快速進行*步分離；低溫下進行分離；在蛋白酶缺陷的宿主中表達重組蛋白
由于不同的色譜方法的原理不同，其對樣品的要求也不相同，所以必須在進行色譜之前，根據特定色譜方法的要求對樣品進行進一步的處理。如下表所示：

不同色譜方法對于樣品的要求：
樣品參數　　 離子交換色譜 　　　疏水作用色譜 　　　　　　凝膠過濾色譜
樣品體積 　　無限制　　　　　　　 無限制 　　　　　　　一般柱體積的1-5%
樣品量　 zui大理論載量的10-20% 　zui大理論載量的10-20% 　僅受到樣品粘度限制
樣品粘度 　　約<50mg/ml 　　　　　約<50mg/ml 　　　　　約<50-100mg/ml
pH值/鹽濃度 同平衡緩沖液（低鹽） 同平衡緩沖液（高鹽） 僅受介質與樣品穩定性限制
有機溶劑 　為減少非特異吸附，可加入有機溶劑（<30%） 分離后，可用有機溶劑進行清洗 僅受介質與樣品穩定性限制
（3）樣品的保存條件：
短期儲存（小于24小時）
a、避免接近或超過樣品的穩定極限防止蛋白質變性或沉淀
b、在密閉容器中冰箱冷藏
較長期儲存（數天）
a、b、同上
c、加入適當的抑菌劑
長期儲存
a、同上
b、冰凍或者凍干（真空冷凍干燥）保存。
3、對每一純化步驟的評價相關方法的建立
a、目的蛋白含量測定
酶活性測定、生物活性測定、放射免疫、酶聯免疫、免疫電泳、熒光。
b、總蛋白含量測定
紫外吸收法、Lowry法、Bradford染料結合法（考馬斯亮蘭G-250）等。
c、樣品復雜度檢測
HPLC（離子交換、凝膠過濾、反相）、SDS-PAGE、等電聚焦、毛細管電泳（CE）。
4、蛋白質的來源
（1）天然蛋白： 天然產物中的目的蛋白一般含量很少而且組分極復雜，在分離過程中須采用多個步驟才能去除各種雜質，并應在整個過程中降低蛋白水解酶的活性。
（2）重組蛋白： 重組蛋白則目標蛋白的豐度較高。重組蛋白主要有三種表達定位：
a、細胞質：在這種情況下，必須破壞細胞結構才能得到目的蛋白質，同時伴隨著大量核酸和其它上千種宿主蛋白質的釋放；在表達量較高的條件下，一般形成包涵體，包涵體含有過表達目的蛋白，且容易通過高速離心分離，但是包涵體的溶解與復性是較復雜的。
b、外周質： 表達的蛋白質存在于細菌內膜與外膜之間，這樣目的蛋白可以較少地受到蛋白酶的作用并減少了宿主蛋白的污染。
c、分泌到培養基：這種表達一般蛋白質濃度較低，主要受到培養基中的污染。
不同來源的蛋白質樣品概述：
來源　　 目的蛋白含量 　　復雜度 　　雜質類型 　　　　色譜前預處理
天然 　　　低 　　　　　　復雜　　固體顆粒、酶 　去除固體顆粒與核酸，抑制蛋白酶
重組 　　細胞質 較高 復雜 細胞碎片，宿主蛋白，核酸，蛋白酶 去除固體顆粒與核酸，抑制蛋白酶
包涵體 很高 低，主要為目的蛋白 高速離心分離，溶解、復性
外周質 高 中等 宿主蛋白，蛋白酶 去除固體顆粒
分泌 低 低，主要含培養基蛋白 培養基，蛋白酶，宿主蛋白 去除固體顆粒，抑制蛋白酶

原文地址:/biotech/exp/protein/Purification/2009/f82016962_1