、免疫動物

免疫動物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠產生致敏B淋巴細胞的 過程。 一般選用6-8周齡雌性BALB/c小鼠，按照預先制定的免疫方案進行免疫注射。 抗原通過血液循環或淋巴循環進入外周免疫器官，刺激相應B淋巴細胞克隆，使其活化、增殖，并分化成為致敏B淋巴細胞。

2、細胞融合

采用二氧化碳氣體處死小鼠，無菌操作取出脾臟，在平皿內擠壓研磨，制備脾細胞懸液。 將準備好的同系骨髓瘤細胞與小鼠脾細胞按一定比例混合，并加入促融合劑聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各種淋巴細胞可與骨髓瘤細胞發生融合，形成雜交瘤細胞。

3、選擇性培養

選擇性培養的目的是篩選融合的雜交瘤細胞，一般采用HAT選擇性培養基。在HAT培養基中，未融合的骨髓瘤細胞因缺乏次黃嘌呤--磷酸核糖轉移酶，不能利用補救途徑合成DNA而死亡。 未融合的淋巴細胞雖具有次黃嘌呤--磷酸核糖轉移酶，但其本身不能在體外存活也逐漸死亡。 只有融合的雜交瘤細胞由于從脾細胞獲得了次黃嘌呤--磷酸核糖轉移酶，并具有骨髓瘤細胞能無限增殖的特性，因此能在HAT培養基中存活和增殖。

4、雜交瘤陽性克隆的篩選與克隆化

在HAT培養基中生長的雜交瘤細胞，只有少數是分泌預定特異性單克隆抗體的細胞，因此，必須進行篩選和克隆化。通常采用有限稀釋法進行雜交瘤細胞的克隆化培養。采用靈敏、快速、特異的免疫學方法，篩選出能產生所需單克隆抗體的陽性雜交瘤細胞，并進行克隆擴增。經過全面鑒定其所分泌單克隆抗體的免疫球蛋白類型、亞類、特異性、親和力、識別抗原的表位及其分子量后，及時進行凍存。

5、單克隆抗體的大量制備

單克隆抗體的大量制備主要采用動物體內誘生法和體外培養法。
()體內誘生法 取BALB/c小鼠，首先腹腔注射0.5ml液體石蠟或降植烷進行預處理。-2周后，腹腔內接種雜交瘤細胞。雜交瘤細胞在小鼠腹腔內增殖，并產生和分泌單克隆抗體。約-2周，可見小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可獲得大量單克隆抗體。
(2)體外培養法 將雜交瘤細胞置于培養瓶中進行培養。在培養過程中，雜交瘤細胞產生并分泌單克隆抗體，收集培養上清液，離心去除細胞及其碎片，即可獲得所需要的單克隆抗體。但這種方法產生的抗體量有限。各種新型培養技術和裝置不斷出現，大大提高了抗體的量。

抗原準備

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抗原，是指能夠刺激機體產生（特異性）免疫應答，并能與免疫應答產物抗體和致敏淋巴細胞在體外結合，發生免疫效應（特異性反應）的物質。抗原的基本特性有兩種，一是誘導免疫應答的能力，也就是免疫原性，二是與免疫應答的產物發生反應，也就是抗原性。
很多物質都可以成為抗原，抗原的具體分類可以參見抗原，在進行單克隆抗體制備過程中，很多物質都可以成為抗原，在常規的科研實驗中，科研者經常選用每只小鼠/大鼠每次注射0~50ug重組蛋白、偶聯多肽、偶聯小分子等作為抗原產生特異性的單克隆抗體。

動物免疫

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單克隆抗體制備的宿主動物一般選用BALB/c小鼠，鼠單抗的應用范圍相當廣泛，一些國內外公司均開發出了兔的單克隆抗體制備技術。
免疫原分為可溶性抗原和顆粒性（細胞）抗原，用無菌鹽水稀釋并與佐劑混合，腹腔注射抗原與佐劑*混勻后形成的穩定乳狀液，在免疫原提供持續的免疫應答基礎上進行加強免疫
周期第天 采血0.2ml（獲得0.ml免疫前血清）
*次免疫（抗原加弗氏*佐劑）
第4天 第二次免疫（抗原加弗氏不*佐劑）
第2天 采血和ELISA檢測
第35天 第三次免疫（抗原加弗氏不*佐劑）
第42天 采血和ELISA檢測
第56天 第四次免疫（抗原溶于PBS或鹽水）
第6天 細胞融合

細胞融合

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（一）融合劑

細胞融合的方法有物理法，如電融合、激光融合，化學融合法和生物融合法，如滅活的仙臺病毒，此處例舉化學融合法中的一種即聚乙二醇融合法。聚乙二醇（PEG），在分子量為200～700時，呈無色、無臭的粘稠狀液體，分子量大于000時，呈乳白色蠟狀固體，能溶于水、乙醇及其他許多有機溶劑，對熱穩定，與許多化學藥品不起作用。用作細胞融合劑的聚乙二醇一般選用分子量為4000者，常用濃度為50%，pH8.0～pH8.2（用0%NaHCO3調整），分子量小的PEG，融合效應差，又有毒性，分子量過大，則粘性太大，不易操作。50%濃度，pH偏堿時融合效應zui高。也有采用30%～50%濃度的PEG加上0%二甲亞砜。不同批號的PEG，即使分子量相同，但融合率卻有明顯差異，選用時必須注意。每批都必須進行細胞毒性試驗后方可應用。要買高純度的，一般選供氣相色譜用的PEG。