富集培養(yǎng)以后的樣品中目的微生物雖然已占了優(yōu)勢(shì)，但其他微生物仍然存在。因此，為了獲得某一特定的微生物菌種，必須對(duì)富集培養(yǎng)后的樣品進(jìn)行純化分離。ELISA試劑盒

()純種分離的基本方法純種分離通常采用稀釋法和畫線法。畫線法是用接種針挑取微生物樣品在固體培養(yǎng)基表面畫線，培養(yǎng)后獲得單菌落。畫線法簡(jiǎn)便、快速，但所得到的單菌落不一定是純種。稀釋法是先將樣品經(jīng)無(wú)菌水或生理鹽水稀釋后，再涂布到固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后獲得單菌落。稀釋法使微生物樣品分散更加均勻，獲得純種的概率更大。

(2)通過(guò)控制營(yíng)養(yǎng)和培養(yǎng)條件進(jìn)行純種分離

①控制分離培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分不同微生物對(duì)碳源、氮源的需求不一樣。因此需要事先了解被分離微生物的營(yíng)養(yǎng)要求，設(shè)計(jì)一種合理快速的分離培養(yǎng)基，這樣就能夠收到事半功倍的效果。例如以淀粉為碳源的培養(yǎng)基可鑒別菌落能否產(chǎn)生；以纖維素為碳源的培養(yǎng)基可鑒別菌落能否產(chǎn)生纖維素酶；以酪蛋白為氮源的培養(yǎng)基可鑒別菌落能否產(chǎn)生蛋白酶。

②控制培養(yǎng)基的pH值不同微生物對(duì)pH值的要求不同。細(xì)菌、放線菌的生長(zhǎng)繁殖一般要求偏堿(pH7．0～7．5)的生長(zhǎng)環(huán)境，而霉菌和酵母菌則要求偏酸(pH4．5～6．0)的生長(zhǎng)環(huán)境。因此．配制分離培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)調(diào)節(jié)pH到被分離微生物的要求范圍，這樣既有利于所需菌種的生長(zhǎng)．也可排除一部分不需要的菌種。例如分離檸檬酸產(chǎn)生菌時(shí)，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH到2．0～2．5，這樣有利于分離到產(chǎn)生檸檬酸的黑曲霉。又如分離堿性蛋白酶和堿性脂肪酶產(chǎn)生菌時(shí)，可以將培養(yǎng)基pH調(diào)到9～，能起到濃縮這些菌種的作用。

    培養(yǎng)基pH還要考慮其他成分。微生物在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中，由于代謝作用，會(huì)產(chǎn)生酸和堿，使pH會(huì)發(fā)生變化。一般培養(yǎng)基C／N高，培養(yǎng)后傾向于酸性，反之則傾向于堿性。無(wú)機(jī)鹽的性質(zhì)也會(huì)影響pH變化，如(NH 4)2 SO4是生理酸性氮源，NaNO3是生理堿性氮源。為了維持培養(yǎng)基的pH值，一般要加入磷酸鹽，使培養(yǎng)基具緩沖能力。如果培養(yǎng)基中的酸堿度變化很大，磷酸鹽的緩沖容量不足，則可加入適量碳酸鈣，以不斷中和菌體代謝過(guò)程中產(chǎn)生的酸類，使培養(yǎng)基的pH保持在恒定的范圍內(nèi)。

③控制培養(yǎng)溫度各類微生物的生長(zhǎng)溫度不同。根據(jù)微生物對(duì)生長(zhǎng)溫度的需求不同，可將微生物分為三類：*類是嗜熱微生物．zui適溫度50～60℃；第二類為嗜溫微生物，zui適生長(zhǎng)溫度是20～40℃；第三類是嗜冷微生物，zui適溫度為5℃以下。因此可控制培養(yǎng)溫度以獲得所需要的微生物。

④供氧條件的控制不同微生物對(duì)氧的需求不一樣，好氧菌要在有氧條件下培養(yǎng)，而厭氧菌則要在厭氧條件下才能生長(zhǎng)。ELISA試劑盒

    分離厭氧菌．要采取厭氧培養(yǎng)法，培養(yǎng)過(guò)程中要除去氧氣。可在分離培養(yǎng)基中加入還原劑．如半、D型、硫化鈉等，快速畫線后，立即置真空密封容器中(充二氧化碳或氮?dú)?；也可利用焦性沒(méi)食子酸和NaOH反應(yīng)，除去氧氣。

(3)利用平皿的生化反應(yīng)進(jìn)行分離(圖2．35) 這是利用特殊的分離培養(yǎng)基對(duì)微生物進(jìn)行初步分離的方法。分離培養(yǎng)基是根據(jù)目的微生物的特殊生理特性或其代謝產(chǎn)物的生化反應(yīng)進(jìn)行設(shè)計(jì)的。通過(guò)觀察微生物在特殊分離培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況或生化反應(yīng)進(jìn)行分離，可顯著提高目的微生物分離純化的效率。

①透明圈法在平板培養(yǎng)基中加入溶解性較差的底物，使培養(yǎng)基混濁。將含目的微生物的待分離樣品接種到此培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，能分解底物的微生物便會(huì)在菌落周圍產(chǎn)生透明圈，透明圈的大小可初步反映該菌株利用底物的能力。該法多用于分離水解酶產(chǎn)生菌，如以淀粉為碳源的培養(yǎng)基可鑒別菌落能否產(chǎn)生；以纖維素為碳源的培養(yǎng)基可鑒別菌落能否產(chǎn)生纖維素酶；以酪蛋白為氮源的培養(yǎng)基可鑒別菌落能否產(chǎn)生蛋白酶。根據(jù)菌落周圍形成的透明圈的有無(wú)和大小，可以大致確定酶活力的有無(wú)和強(qiáng)弱。

    產(chǎn)有機(jī)酸的微生物也可采用透明圈法進(jìn)行分離。在分離培養(yǎng)基中加碳酸鈣，使之形成混濁狀，把土樣懸浮液涂到平板上，如在培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)酸，則能把菌落四周的碳酸鈣水解，形成清晰的透明圈。

②變色圈法在分離培養(yǎng)基中加入指示劑或顯色劑，可使所需微生物能被鑒別出來(lái)。如分離產(chǎn)生菌時(shí)．在培養(yǎng)基中加入溴百里酚藍(lán)，它是一種酸堿指示劑，變色范圍在pH6．2～7．6，當(dāng)pH6．2以下時(shí)為黃色，當(dāng)pH7．6以上時(shí)為藍(lán)色。若平板上出現(xiàn)產(chǎn)酸菌，其菌落周圍會(huì)變成黃色，可挑取黃色菌落，進(jìn)一步篩選產(chǎn)生菌。

    分離降脂微生物的常用方法是把維多利亞蘭和脂類混合，制成瓊脂培養(yǎng)基平板，起始pH調(diào)為中性，將土樣懸浮液分離在平板上，具有降脂能力的菌落產(chǎn)生脂酶，水解脂類底物，使pH由中性下降到酸性，即陽(yáng)性降脂反應(yīng)能顯示粉紅色到藍(lán)色的變化。若起始pH為
堿性．則陽(yáng)性降脂反應(yīng)從咖啡色變成藍(lán)綠色，能使脂類底物與降脂后的脂肪酸區(qū)別開(kāi)來(lái)。

    分離蛋白酶產(chǎn)生菌時(shí)．除可用酪蛋白作底物，觀察菌落周圍有無(wú)透明圈外，還可以吲羥乙酸酯為底物，能產(chǎn)生堿性蛋白酶的芽胞桿菌菌落，由于水解吲羥乙酸酯而產(chǎn)生3一羥基吲哚，后者能氧化產(chǎn)生藍(lán)色產(chǎn)物，以此鑒別菌落是否產(chǎn)蛋白酶。

③生長(zhǎng)圈法生長(zhǎng)圈法通常用于分離和篩選產(chǎn)生氨基酸、核苷酸和維生素的微生物。所用工具菌是一些相對(duì)應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株。將待分離菌株涂布于含高濃度的工具菌并缺少所需營(yíng)養(yǎng)物的平板上進(jìn)行培養(yǎng)，則在能合成該營(yíng)養(yǎng)物的菌落周圍會(huì)產(chǎn)生一個(gè)混濁的生長(zhǎng)圈。

④抑菌圈法抑菌圈法常用于分離和篩選產(chǎn)生抗生素的微生物。所用工具菌為抗生素的敏感菌。若被分離微生物能產(chǎn)生某種抗生素．便會(huì)在該菌落周圍形成工具菌不能生長(zhǎng)的抑菌圉。ELISA試劑盒

    利用抑菌圈法還能篩選產(chǎn)生某些酶類的微生物。如可利用抑菌圈法篩選酰化酶產(chǎn)生菌。工具菌為一種對(duì)芐抗性而對(duì)6一氨基青霉烷酸(6一APA)敏感的黏性沙雷氏菌。這種菌只有當(dāng)芐青霉索尚未被酰化酶轉(zhuǎn)化為6一APA時(shí)才能生長(zhǎng)。具體做法是將工具菌和芐混合于平板培養(yǎng)基中，將待分離菌涂布于平皿上培養(yǎng)．凡菌落周圍出現(xiàn)抑菌圈的即為酰化酶產(chǎn)生菌。