實體組織材料的分離方法

    對于實體組織材料，細胞間結合緊密，可采用機械分散法和消化分離法使組織中的細胞寬分分散，形成細胞懸液。

(一)機械分散法

    機械分散法，指通過各種各樣的物理學處理手段，將所取得動物組織解離成為單個細胞藥方法，包括切割分離法和機械分散法。

．材料

()標本：各類實體組織材料。

(2)試劑：Hanks液、培養液。

(3)器具：手術刀、眼科剪、不銹鋼(rg龍)的篩網、平皿、三角燒瓶。

2．機械分散的操作步驟

()切割分離法：無菌切取cm3一塊組織，置人小燒杯中，左手斜持容器，右手持長柄眼科剪伸入容器中，反復剪切組織至lmm3大小，用吸管吸取Hanks液把附著在剪刀上的組織小塊沖下。并再補充適量的Hanks液后，用吸管反復輕柔吹打片刻，低速離心，棄上清液，余下的組織塊可用于細胞培養。

(2)機械分散法：所取標本是纖維成分很少的軟組織，如腦組織，部分胚胎組織及一些腫瘤組織。將組織塊處理成小塊后，可將組織放在注射器針管中擠壓或在不銹鋼紗網內用鈍物壓擠(常用注射器鈍端)使細胞從網孔中壓擠出。此法分離細胞雖然簡便、快速，但對組織機械損傷大，而且細胞分散效果差，僅適用于處理纖維成分少的軟組織。

(二)消化分離法

    消化分離法是把切成較小體積，應用酶的生化作用和非酶的化學作用進一步分散組織的方法。zui后使被處理的組織分散成細胞團或單個細胞，加入培養液后制成細胞懸液，接種入培養容器中后，細胞容易生長繁殖。各種消化劑作用機制各不相同，根據組織的不同．可選用特定的消化手段。使用的消化劑包括酶類和非酶EDTA。

．消化分離法種類

()消化法：(簡稱)是廣泛應用的消化劑。對細胞的作用，取決于細胞類型、酶的活力、配制的濃度、消化的溫度、無機鹽離子、pH以及消化時間的長短等。適于消化細胞問質較少的軟組織，能有效地分離肝、腎、甲狀腺、羊膜、胚胎組織、上皮組織等。鈣、鎂離子對的活性有一定的抑制作用，兇此，采用無鈣、鎂離子的PBS。一般采用的濃度為0．％～0．25％(活力l：200或：250)。常使用的消化溫度為37℃，消化分離細胞時pH適宜選用7．6～8．0之間，否則對細胞有損傷。消化5mm3大小的軟組織，消化時間為20~30min為宜，但遇到難消化的組織時，濃度可適當提高，消化時間適當延長至數小時。可采用冷消化，使用低濃度消化液，于4℃過夜。

(2)膠原酶消化法：膠原酶是一種從細菌中提取出來的酶，對膠原有很強的消化作用。適于消化纖維性組織、上皮組織以及癌組織，同時對細胞間質有較好的消化作用，而使細胞不受傷害。該酶在有鈣、鎂離子存在仍有活性，故可用PBS和含血清的培養液配制，zui終濃度200U／ml或0．～O．3μg／ml。此酶消化作用緩和，無需機械振蕩，但膠原酶價格較高，大量使用將增加實驗成本。

    由于上皮細胞對酶有耐受性，經過膠原酶消化后的上皮組織，可能有一些上皮細胞團塊尚未被*消化開。成小團塊的上皮細胞比分散的單個上皮細胞更易生長，因此不必要冉進一步消化處理。

(3)EDTA消化法：EDTA是一種非酶消化物。常用不含鈣、鎂離子的PBS配成0．02％工作液，對一些組織．尤其是上皮組織分散效果好。EDTA能與細胞上的鈣、鎂離子結合形成螯合物，利用結合后的機械力使細胞變圓而分散細胞或使貼壁細胞從瓶壁上脫離。EDTA常不單獨使用，可與混合使用(：或2：)，不僅利于細胞脫壁又利于細胞分散，可降低的用量和毒性作用。

2．材料

()標本：各類實體組織材料。

(2)試劑：消化液、PBS、Hanks液、培養液。

(3)器具：眼科剪、不銹鋼(尼龍)的篩網；平皿、三角燒瓶、吸管、離心管、培養瓶、載玻片。

3．消化分離法的操作步驟(以消化為例)

()漂洗：將組織塊在三角燒瓶(或平皿)中用無鈣、鎂PBS液洗2～3次。

(2)剪切：組織塊剪碎，剪成3~5mm。大小的小塊。

(3)消化：剪碎的組織塊放人三角燒瓶中，加入比組織量多30~50倍的0．25％消化液。置于電磁攪拌器臺上，消化30~60min，或置于37℃水浴鍋(37℃溫箱中)，中間每隔5～0 min可輕搖次，組織塊膨松呈絮狀可終止。如果需要長時間的消化可更換一次消化液，靜止三角燒瓶0min，待組織下沉后，吸出2／3上清液，余下／3，再補加新的消化液，繼續消化。

(4)消化完畢，倒入離心管中，800r／min離心6~8min，去上清液。

(5)漂洗：采用Hanks液漂洗2~3min，離心去上清液，共2次。

(6)低速離心(500~000r／min)：離心5min，去上清液，加入一定量的培養液，通過00μm的網眼的尼龍網或不銹鋼紗網濾過，以除去未消化的較大組織塊；如果消化*可不用濾過。用吸管吸取一滴細胞懸液滴于載玻片上觀察，如果細胞分散良好，形態整，即可用于培養。

4．注意事項

()組織塊必須漂洗2～3次以除去組織中的鈣、鎂離子和血清對的抑制作用。

(2)濃度高對細胞有毒性，濃度不宜過高；作用時間不能太長，以避免毒性作用。

(3)消化后組織不僅要盡量棄去消化液，以避免毒性產生，而且動作要輕以避免蓬松的細胞隨漂洗而丟失。