快速提取全血RNA的操作步驟

操作步驟：
*次使用前請先在漂洗液RW瓶和70%乙醇瓶中加入量無水乙醇!
使用前將0X紅細胞裂解液RLB用DEPC處理水稀釋到X.
操作前在裂解液RLT中加入β-巰基乙醇至終濃度%,如 ml RLT 中加入0μl β-巰基乙醇.此裂解液現(xiàn)用現(xiàn)配.配好的RLT 4℃可放置一個月.

. 在適合大小的RNase free離心管中加入體積（<.5 ml）加入各種抗凝劑新鮮血液 （顛倒混勻后）和3體積的紅細胞裂解液RLB,顛倒混勻,可輕彈管壁,確保混勻.

2. 室溫放置0分鐘（期間應(yīng)該顛倒輕彈混勻數(shù)次幫助裂解紅細胞）.
如果RNA降解嚴重,可在冰上裂解,但是時間可長一些以充分裂解.

3. 2,000 rpm離心20秒,倒棄紅色上清,并小心的盡可能多的吸棄上清（注意不要吸到管底的細胞團）,留下完整的管底白細胞團. 

離心后在管底應(yīng)該見到白色的白細胞團,也可能有一些紅細胞殘片和白細胞團在一起,但是如果看到的是大部分的紅色細胞團,說明紅細胞裂解很不充分,應(yīng)該再加入紅細胞裂解液重懸細胞團后重復步驟2,3.

上清盡可能的吸棄,殘留過多會稀釋裂解液,造成裂解結(jié)合異常,產(chǎn)量純度降低.

4. 渦旋或者輕彈管壁將白細胞沉淀*松散重懸,加入350μl（<0.5 ml全血）或者600μl（0.5-.5ml全血）裂解液RLT,吹打混勻后用手劇烈振蕩20秒,充分裂解.病人血樣中白細胞數(shù)量可能大幅增加,應(yīng)該適當減少處理量.或者按照350μl（<2x06白細胞）或者600μl（2x06-x07白細胞）比例加RTL.

5. 用帶鈍針頭的一次性 ml（配0.9mm針頭） 注射器抽打裂解物 5-0 次或直到得到滿意勻漿結(jié)果（或者電動勻漿30秒）,可以剪切DNA,降低粘稠度和提高產(chǎn)量.

6. 較估計裂解物體積,加入等體積的70%乙醇（請先檢查是否已加入無水乙醇!）,此時可能出現(xiàn)沉淀,但是不影響提取過程,立即吹打混勻,不要離心.

7. 立刻將混合物（每次小于700μl,多可以分兩次加入）加入一個吸附柱RA中,（吸附柱放入收集管中）3,000 rpm離心60秒,棄掉廢液.

8. 加700μl 去蛋白液RW,室溫放置30秒,2,000rpm 離心30秒,棄掉廢液.
如果DNA殘留明顯,可在加入RW后室溫放置5分鐘再離心.

9. 加入500μl漂洗液RW（請先檢查是否已加入無水乙醇!）,2,000 rpm 離心30秒,棄掉廢液.加入500μl漂洗液RW,重復一遍.

0. 將吸附柱RA放回空收集管中,3,000 rpm離心2分鐘,盡量除去漂洗液, 以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng).

. 取出吸附柱RA,放入一個RNase free離心管中,根據(jù)預(yù)期RNA產(chǎn)量在吸附膜的中間部位加30-50μl RNase free water（事先在 70-80℃水浴中加熱效果更好）, 室溫放置分鐘,2,000 rpm 離心分鐘.

2. 如果提取全血>0.5 ml或者>2x06白細胞,加30-50μl RNase free water重復步驟,合并兩次洗脫液,或者使用*次的洗脫液加回到吸附柱重復步驟一遍（如果需要RNA濃度高）.

洗脫兩遍的RNA洗脫液濃度高,分兩次洗脫合并洗脫液的RNA產(chǎn)量比前者高5–30%,但是濃度要低,用戶根據(jù)需要選擇.