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豬白細胞介素(IL-)ELISA試劑盒技術分析

時間:2014/9/10閱讀:591
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豬白細胞介素(IL-)ELISA試劑盒技術分析

ELISA試劑盒實驗原理
本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中豬白細胞介素 (IL-)水平。用純化的豬白細胞
介素 (IL-)抗體包被微孔板,制成固相抗體,往包被單抗的微孔中依次加入白細胞介素
(IL-),再與 HRP 標記的白細胞介素 (IL-)抗體結合,形成抗體-抗原-酶標抗體復合物,
經過*洗滌后加底物 TMB 顯色。TMB 在 HRP 酶的催化下轉化成藍色,并在酸的作用下
轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的白細胞介素 (IL-)呈正相關。用酶標儀在 450nm
波長下測定吸光度(OD 值),通過標準曲線計算樣品中豬白細胞介素 (IL-)濃度。
標本要求
.標本采集后盡早進行提取,提取按相關文獻進行,提取后應盡快進行實驗。若不能
馬上進行試驗,可將標本放于-20℃保存,但應避免反復凍融
2.不能檢測含 NaN3 的樣品,因 NaN3 抑制辣根過氧化物酶的(HRP)活性。
ELISA試劑盒操作步驟
.標準品的稀釋:本試劑盒提供原倍標準品一支,用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀
釋。
20 ng/L
5 號標準品
50µl 的原倍標準品加入 50µl 標準品稀釋液
60 ng/L
4 號標準品
50µl 的 5 號標準品加入 50µl 標準品稀釋液
30 ng/L
3 號標準品
50µl 的 4 號標準品加入 50µl 標準品稀釋液
5 ng/L
2 號標準品
50µl 的 3 號標準品加入 50µl 標準品稀釋液
7.5 ng/L
號標準品
50µl 的 2 號標準品加入 50µl 標準品稀釋液
2.加樣:分別設空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標試劑,其余各步操作相同)、標準孔、
待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣 50µl,待測樣品孔中先加樣品稀釋液 40µl,
然后再加待測樣品 0µl(樣品zui終稀釋度為 5 倍)。加樣將樣品加于酶標板孔底部,盡
量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻。
3.溫育:用封板膜封板后置 37℃溫育 30 分鐘。
4.配液:將 30 倍濃縮洗滌液用蒸餾水 30 倍稀釋后備用
5.洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置 30 秒后棄去,如此
重復 5 次,拍干。
6.加酶:每孔加入酶標試劑 50µl,空白孔除外。
7.溫育:操作同 3。
8.洗滌:操作同 5。
9.顯色:每孔先加入顯色劑 A50µl,再加入顯色劑 B50µl,輕輕震蕩混勻,37℃避光顯色
0 分鐘.
0. 終止:每孔加終止液 50µl,終止反應(此時藍色立轉黃色)。
. 測定:以空白空調零,450nm 波長依序測量各孔的吸光度(OD 值)。 測定應在加終止
液后 5 分鐘以內進行。
操作程序總結:
ELISA試劑盒計算
以標準物的濃度為橫坐標,OD 值為縱坐標,在坐標紙上繪出標準曲線,根據樣品的
OD 值由標準曲線查出相應的濃度;再乘以稀釋倍數;或用標準物的濃度與 OD 值計算出標
準曲線的直線回歸方程式,將樣品的 OD 值代入方程式,計算出樣品濃度,再乘以稀釋倍數,
即為樣品的實際濃度。
注意事項
.試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡 5-30 分鐘后方可使用,酶標包被板開封后如未
用完,板條應裝入密封袋中保存。
2.濃洗滌液可能會有結晶析出,稀釋時可在水浴中加溫助溶,洗滌時不影響結果。
3.各步加樣均應使用加樣器,并經常校對其準確性,以避免試驗誤差。一次加樣時間
控制在 5 分鐘內,如標本數量多,使用排槍加樣。
4.請每次測定的同時做標準曲線,做復孔。如標本中待測物質含量過高(樣本 OD 值
大于標準品孔*孔的 OD 值),請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(n 倍)后再測定,計
算時請zui后乘以總稀釋倍數(×n×5)。
5.封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。
6.底物請避光保存。
7.嚴格按照說明書的操作進行,試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準.
8.所有樣品,洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。
9.本試劑不同批號組分不得混用。
保存條件及有效期
.試劑盒保存:;2-8℃。

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