1 實時定量RT - PCR的原理、方法和應用
1. 1 實時定量RT - PCR的原理
實時定量pcr的發明歸功于兩個重要的發現:一是發現DNA Taq酶有5′ 3′外切酶活性,二是利用熒光能量傳遞技術構建了雙標記寡核苷酸探針,即TaqMan探針。在PCR過程中,這些熒光信號可以被探測器所“即時”捕獲,電腦軟件可以通過等式ΔRn = R+n - R-n 計算ΔRn ,其中, R+n 是表示每點測量的熒光強度, R-n 表示熒光基線強度,ΔRn 的值表示PCR過程中,探針降解的量,就是PCR產物的量[ 3 ] 。以ΔRn的值對循環數作曲線,選擇一個熒光閾值,熒光達到熒光閾值的循環數叫做閾值循環數(Cycle Threshold,Ct ) ,而Ct 值隨這些起始模板量的增加而線性降低,從而可以通過Ct 值推算起始模板量。該方法的特異性由引物和探針的特異性所決定,只有在PCR過程中,探針退火到目標片段才能發出熒光信號。
SYBR Green I是一種DNA結合染料,能非特異地摻入到雙鏈DNA中去,在游離狀態下,它不發出熒光,但一旦結合到雙鏈DNA中以后,便可發出熒光,可以與任意引物、模板相配合,用于任意反應體系中,因此,在一個反應體系內,其信號強度代表了雙鏈DNA分子的數量。它的缺點是能與非特異性雙鏈DNA(如引物二聚體)結合,但其產生的干擾可通過熔解曲線分析得到解決[ 4 ] 。
分子信標(molecular Beacons) ,是一種單鏈DNA形成的發夾結構,在其一端有一報告基團,在另一端有淬滅基團,當它形成發夾結構時,由于熒光報告基團與淬滅基團相互靠近,兩者之間發生熒光信號能量共振轉移( FRET) ,當熱循環溫度達到分子信標的解鏈溫度時,其構象發生改變,能與模板結合而*伸展成線性分子,使得FRET消失,報告基團發出熒光信號。
Amp liSensor技術:該技術與Taqman PCR的區別在于其采用的是復合探針。一個探針上標以熒光報告基團,另一個探針上標以熒光淬滅基團,后者的5′端較前者多出7個堿基(GCGTCCC) 。兩探針之間能因堿基互補而結合,此時,兩基團靠近而形成FRET結構,報告基團的熒光信號被淬滅基團吸收。當兩探針分開后,其間的FRET關系受到破壞,淬滅基團的抑制作用解除,報告基團的熒光信號得到釋放。在PCR擴增前需將該復合探針與一個半套式PCR引物連接,該引物的5′端應具有一段與長探針上多出的7個堿基互補的序列,以便DNA連接酶能將該引物與短探針連接,擴增時,該探針- 引物復合物作為半套式引物摻入到模板,并釋放出淬滅探針,使原有的FRET結構破壞,從而釋放出報告基團的熒光信號,其強度與被擴增的模板數相對應[ 5 ] 。
L ightcycle技術:該技術的特點也是將熒光報告基團和淬滅基團分別標記在兩個不同的探針上,形成熒光探針和淬滅探針。熒光報告基團標記探針的5′端,熒光淬滅基團標記探針的3′端,兩探針能分別與模板同一條鏈中相鄰的核苷酸序列進行雜交。當探針游離時能檢測到報告基團的熒光信號,如果反應體系中存在特異性模板, PCR復性階段兩探針即會與之雜交,此時兩探針上的熒光報告基團和淬滅基團相距較近,形成FRET關系,前者的熒光信號被后者吸收,即發生熒光淬滅。由于熒光淬滅的程度與被擴增的模板量相對應,可達到定量目的[ 5 ] 。
Comp lex探針技術:該技術的特點是先合成熒光探針和淬滅探針,熒光探針為25個堿基左右, 5′端有熒光報告基團,淬滅探針長度為15個堿基左右, 3′端有熒光淬滅基團,并能與熒光探針5′端雜交。當熒光報告基團與淬滅基團靠近時,熒光信號被吸收。當反應體系中沒有特異性模板時,不能檢測到報告基團的熒光信號。當有特異性模板存在時,在PCR復性階段熒光探針優先與模板結合,以致兩探針分離,報告基團的熒光信號可被釋放出來,其強度與被擴增的模板數量成正比,因而可進行PCR定量[ 5 ] 。
1. 2 方法
首先提取細胞因子mRNA,合成cDNA,可以采用TR Izol試劑盒,也可以采用Higher Pure RNA isolationkit從組織中提取RNA,所得到的RNA必須有較高的純度,且不含DNA;然后,確定管家基因,設計引物和探針;再進行PCR擴增和基因定量。