首先引物設(shè)計(jì)
引物設(shè)計(jì)有3 條基本原則：首先引物與模板的序列要緊密互補(bǔ)，其次引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)，再次引物不能在模板的非目的位點(diǎn)引發(fā)DNA 聚合反應(yīng)(即錯(cuò)配)。
具體實(shí)現(xiàn)這3 條基本原則需要考慮到諸多因素，如引物長度（primer length），產(chǎn)物長度 （product length），序列Tm 值 (melting temperature)，引物與模板形成雙鏈的內(nèi)部穩(wěn)定性(internal stability, 用ΔG 值反映)，形成引物二聚體(primer dimer)及發(fā)夾結(jié)構(gòu)（duplex formation and hairpin）的能值，在錯(cuò)配位點(diǎn)（ false priming site ） 的引發(fā)效率， 引物及產(chǎn)物的GC 含量（composition），等等。必要時(shí)還需對引物進(jìn)行修飾，如增加限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，引進(jìn)突變等。根據(jù)有關(guān)參考資料[24]，引物設(shè)計(jì)應(yīng)注意如下要點(diǎn)：
（1）引物的長度一般為15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不應(yīng)大于38，因?yàn)檫^長會導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃，不適于taq DNA 聚合酶進(jìn)行反應(yīng)。
（2）引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有相似性較高，尤其是3’端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯(cuò)配。引物3’端出現(xiàn)3 個(gè)以上的連續(xù)堿基，如GGG 或CCC，也會使錯(cuò)誤引發(fā)機(jī)率增加。
（3）引物3’端的末位堿基對Taq 酶的DNA 合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯(cuò)配位置導(dǎo)致不同的擴(kuò)增效率，末位堿基為A 的錯(cuò)配效率明顯高于其他3 個(gè)堿基，因此應(yīng)當(dāng)避免在引物的3’端使用堿基A。另外，引物二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致PCR 反應(yīng)失敗。5’端序列對PCR 影響不太大，因此常用來引進(jìn)修飾位點(diǎn)或標(biāo)記物。
（4）引物序列的GC 含量一般為40-60%，過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC 含量不能相差太大。
（5）引物所對應(yīng)模板位置序列的Tm 值在72℃左右可使復(fù)性條件。Tm 值的計(jì)算有多種方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo 軟件中使用的是zui鄰近法(the nearest neighbor method) 。
（6）ΔG 值是指DNA 雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對的相對穩(wěn)定性。應(yīng)當(dāng)選用3’端ΔG 值較低（值不超過9），而5’端和中間ΔG 值相對較高的引物。引物的3’端的ΔG 值過高，容易在錯(cuò)配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA 聚合反應(yīng)。
（7）引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值過高（超過4.5kcal/mol）易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR 反應(yīng)不能正常進(jìn)行[8]。
（8）對引物的修飾一般是在5’端增加酶切位點(diǎn)，應(yīng)根據(jù)下一步實(shí)驗(yàn)中要插入PCR 產(chǎn)物的載體的相應(yīng)序列。

1.1.1 PCR 的引物設(shè)計(jì)
首先從GenBank 查到VI 型膠原蛋白的α1 鏈的mRMA 序列，序列號為 NM_001848.其序列長為 4164bp，其中98 到3184 為VI 型膠原蛋白的α1鏈的編碼序列，98 到865 編碼VI 型膠原蛋白的α1 鏈的氨基端球狀結(jié)構(gòu)域，
866 到1873 編碼膠原的三股螺旋結(jié)構(gòu)域，1874 到3181 編碼VI 型膠原蛋白的α1 鏈的羧基端球狀結(jié)構(gòu)域。
接著采用Primer Premier 5.0 進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)結(jié)果如下：

我的RT

我的RT 
圖2-1 Primer Premier 5.0 進(jìn)行引物設(shè)計(jì)
由表中可知引物的GC 含量較高，擴(kuò)增的片斷較長，而且存在錯(cuò)配和引
物二聚體，在進(jìn)行PCR 擴(kuò)增時(shí)存在一定的困難。