外源ＤＮＡ片段和線狀質粒載體的連接，也就是在雙鏈ＤＮＡ５"磷酸和相鄰的3"羥基之間 形成的新的共價鏈。如質粒載體的兩條鏈都帶5"磷酸，可生成４個新的磷酸二酯鏈。但如果質粒ＤＮＡ已去磷酸化，則吸能形成２個新的磷酸二酯鏈。在這種情況下產生的兩個雜交體分子帶有２個單鏈切口，當雜本導入感受態細胞后可被修復。相鄰的５"磷酸和３"羥基間磷酸二酯鍵的形成可在體外由兩種不同的ＤＮＡ連接酶催化，這兩種酶就是大腸桿菌ＤＮＡ連接酶和Ｔ４噬菌體ＤＮＡ連接酶。實際上在有克隆用途中，Ｔ４噬菌體ＤＮＡ連接酶都是的用酶。這是因為在下沉反應條件下，它就能有效地將平端ＤＮＡ片段連接起來。
　　ＤＮＡ一端與另一端的連接可認為是雙分子反應，在標準條件下，其反應速度*由互相匹配的ＤＮＡ末端的濃度決定。不論末端位于同一ＤＮＡ分子（分子內連接）還是位于不同分子（分子間連接），都是如此。現考慮一種簡單的情況，即連接混合物中只含有一種ＤＮＡ，也就是用可產生粘端的單個限制酶切割制備的磷酸化載體ＤＮＡ。在瓜作用的底物。如果反應中ＤＮＡ濃度低，則配對的兩個末端同一ＤＮＡ分子的機會較大（因為ＤＮＡ分子的一個末端找到同一分子的另一末端的概率要高于找到不同ＤＮＡ分子的末端的概率）。這倦，在ＤＮＡ濃度低時，質粒ＤＮＡ重新環化將卓有成效。如果連接反應中ＤＮＡ濃度有所增高，則在分子內連接反應發生以前，某一個ＤＮＡ分子的末端碰到另一ＤＮＡ分子末端的可能性也有所增大。因此在ＤＮＡ濃度高時，連接反的初產物將是質粒二聚體和更大一些的寡聚體。Dugaiczyk等(1975;同時參見Bethesda Res,Lab.出版的Focus第2卷，第２、３期合刊)從理論上探討了ＤＮＡ濃度對連接產物性質的影響。簡而言之，環化的連接產物與多聯體連接產物的比取決于兩個參數：j和i。j是ＤＮＡ分子的一個末端在同一分子的另一末端附近的有效濃度，j的數值是根據如下一種假設作出的：沉吟液中的ＤＮＡ呈隨機卷曲。這樣，j與ＤＮＡ分子的長度成反比（因為ＤＮＡ越長，某一給定分子的兩末端的越不可能相互作用），因此j對給定長度的ＤＮＡ分子來說是一個常數，與ＤＮＡ深度無關。j＝[3/(3πlb0)]3/2其中l是ＤＮＡ長度，以cm計，b 是隨機卷曲的ＤＮＡ區段的長度。b的值以緩沖液的離子強度為轉移，而后者可影響ＤＮＡ的剛度。
i是溶液中所有互補末端的深度的測量值，對于具有自身互補粘端的雙鏈dna而言，i=2NoMx10-3末端/ml這里Ｎo是阿佛伽德羅常數，Ｍ是ＤＮＡ的摩爾濃度（單位：mol/L）。理論上，當j=i時，給定ＤＮＡ分子的一個末端與同一分子的另一末端，以及與不同分子的末端相接觸的可能性相等。因而在這樣的條件下，在反應的初始階段中，環狀分子與多聯體分子的生成速率相等。而當j>i時，有利于重新環化；當i>j，則有利于產生多聯體。圖1.9顯示了ＤＮＡ區段的大小與連接反應混合物中j:i之比分別為0.5、1、2和5時所需ＤＮＡ濃度之間關系（Ｄugaiczyk等， 1985）。 現在考慮如下的連接反應混合物：其中除線狀質粒之外，還含有帶匹配末端的外源ＤＮＡ片段。對于一個給定的連接混合物而言，產生單體環狀重組基因組的效率不僅受反應中末端的濃度影響， 而且還受質粒和外源ＤＮＡ末端的相對濃度的影響。當i是j的２－３倍（即末端的濃度足以滿足分子間連接的要求，而又不致引起大量寡聚體分子的形成時）外源ＤＮＡ末端濃度的２倍時，有效重組體的產量可達到zui大。這些條什下，連接反應終產物的大約40％都是由單體質粒與外源ＤＮＡ所形成的嵌合體。當連接混合物中線瘃質粒的量恒定（j:i=3）而帶匹配末端的外源ＤＮＡ的量遞增時，這種嵌合體在連接反應之末的理論產量。