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上海金穗生物科技有限公司

噬菌體展示文庫fUSE5活體篩選特殊步驟

時間:2012-12-19閱讀:636
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1.為了洗脫細菌,將900ul的K91 Kan Terrific肉湯菌液加入裂解后的細胞,并于室溫下孵育20分鐘。

2.將步驟1所得全部倒入含有9m1四環素濃度為0.2ug/ml的NZY培養基的50m1錐形瓶中。室溫下孵育30分鐘。

3.為了測定fd噬菌體的產出量,將步驟2所得分別取1ul、10ul及100ul,涂布到四環素濃度為40ug/ml的LB瓊脂平板中,每種涂布3個。可以采用玻璃或金屬刮子,或無菌玻璃珠,來涂布細菌。將平板置于37℃孵育16小時(過夜)。

4.為了測定每份器官或組織的噬菌體總產出量,將每個平板上的克?。═U)數目除以涂板的體積(1ul、10ul或100ul),然后再乘以10000ul。這樣計算的原因是:步驟2中稀釋了10倍,而加到沉淀中的是1000ul K91Kan菌液。例如:在腦組織的10ul培養基平板中平均有200TU的噬菌體,那么在每克腦組織中噬菌體總產出量為2.0×105TU。對每份器官和組織中三個平板的計數取平均值,并對數據作圖。

5.為了擴增及純化回收的“噬菌體, 當把樣品涂布在平板上以后,在2L的錐形瓶中將步驟2所剩的9.67ml樣品加到含40ug/ml四環素的200ml的NZY培養基中,于37℃搖瓶培養16小時(過夜)。

6.把過夜培養的菌液倒入300m1的離心管中,在Sorvall@SLA—3000轉子中以8000r/min離心15分鐘。通過帶0.2um濾膜的真空抽濾瓶將上清過濾到500ml無菌瓶中。

7,通過向每200ml噬菌體中添加40ml的PEG/NaCl溶液,把上清中的噬菌體沉淀下來,并于4℃孵育4~16小時。

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