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上海金穗生物科技有限公司

scFv和載體DNA的連接

時(shí)間：2012-9-7閱讀：641
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[器材和試劑]
●T4DNA連接酶及10×緩沖液（NEB）
●酚/氯仿（Sigma）
●100%和70%乙醇，-20℃保存
●消化的載體和scFv文庫(kù)
●TE（10mmol/L Tris pH 8，lmmol/L EDTA）
 
[方法]
1.如下所述，配制兩個(gè)100ul連接混合液，其中1個(gè)用于VH-VκscFv文庫(kù)，另1個(gè)用于Vu-VλscFv文庫(kù)，并設(shè)置兩個(gè)對(duì)照反應(yīng)。對(duì)照可以確定未切的載體有多少（對(duì)照2），以及確定無(wú)插入序列時(shí)有多少重新連接的載體（對(duì)照1）。要保持恰當(dāng)?shù)谋壤@得的克隆數(shù)（對(duì)于相同的連接體積）應(yīng)當(dāng)小于基因文庫(kù)的10%。
                                                        對(duì)照1         對(duì)照2
●10×連接緩沖液                              10ul      0．5ul        0．5ul
●Millipore水                                32ul       2．3ul        2．5ul
●已消化的pHENl 100ng/ul                     40ul       2．Oul        2．0ul
●ScFv基因文庫(kù)（100ng/ul）                     14ul
●T4 DNA連接酶（400U/ul）                      4ul        0．2ul
2．孵育混合液，16℃過(guò)夜。
3．加入TE使反應(yīng)混合液體積增加至200ul。用等體積酚/氯抽提DNA。用乙醇沉淀DNA并用70%乙醇洗滌沉淀2次。

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