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細胞抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）活性染色試劑盒產(chǎn)品說明書
點擊次數(shù)：377 發(fā)布時間：2014-12-10
YIJI細胞抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）活性染色試劑盒產(chǎn)品說明書
主要用途
YIJI細胞抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）活性染色試劑是一種旨在使用偶聯(lián)偶氮技術(shù)，在酸性環(huán)境和酒石酸存在的情況下， 呈現(xiàn)出紫紅色沉淀現(xiàn)象，來分析細胞樣本中抗酒石酸酸性磷酸酶表達的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心改良、成功實驗證明的。主要適用于動物原生代或培養(yǎng)細胞尤其是骨髓細胞和破骨細胞的抗酒石酸酸性磷酸酶活性檢測。可用于骨質(zhì)細胞病理生理的研究的鑒定。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，靈敏牢固，顯色清晰。
技術(shù)背景
抗酒石酸酸性磷酸酶（Tartrate resistant acid phosphatase；TRAP）是一種在哺乳動物內(nèi)表達的糖化單體金屬蛋白酶，970多堿基，320多氨基酸，分子量為35kD。作為破骨細胞的標(biāo)志，抗酒石酸酸性磷酸酶與破骨細胞調(diào)節(jié)的骨resorption活性和骨生成代謝有關(guān)。抗酒石酸酸性磷酸酶是以酶原形式合成，通過蛋白酶裂解和還原后活化。在酸性環(huán)境下，催化磷酸酯鍵的水解，產(chǎn)生醇和釋放磷酸。其特征性為酒石酸抗性而與其它酸性磷酸酶區(qū)別。抗酒石酸酸性磷酸酶在破骨細胞（osteoclast）、活化的巨噬細胞、神經(jīng)細胞以及懷孕期的豬內(nèi)皮層子宮內(nèi)膜（endometrium）高度表達。在網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖（leukaemic reticuloendotheliosis）或毛細胞性白血病（hairy cell leukaemia）、戈謝病（Gaucher’s disease）、愛茲性腦病（HIV-induced encephalopathy）、骨巨細胞瘤（osteoclastoma）、骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis）和代謝性骨病等病人體內(nèi)抗酒石酸酸性磷酸酶顯著增高。基于底物萘酚AS-MX磷酸鹽（naphthol AS-MX phosphate），在酸性環(huán)境和酒石酸（tartrate）存在的條件下，酸性磷酸酶催化其水解，釋放出萘酚（naphthol-AS），進而與重氮鹽耐曬紅紫（Fast red violet）偶聯(lián)，于是在酶的活動處形成不溶性紫紅色沉淀的偶氮染料，由此證明抗酒石酸酸性磷酸酶活性。其反應(yīng)體系為：
產(chǎn)品內(nèi)容
YIJI清理液（Reagent A） 毫升
YIJI固著液（Reagent B） 毫升
YIJI反應(yīng)液（Reagent C） 微升
YIJI染色液（Reagent D） 毫升
產(chǎn)品說明書 1份
保存方式
保存YIJI反應(yīng)液（Reagent C）和YIJI染色液（Reagent D）在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月
用戶自備
甲基綠復(fù)染試劑盒（YJ40010）：用于常規(guī)染色后復(fù)染
1.5毫升離心管：用于配制染色工作液的容器
恒溫培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)孵育
光學(xué)顯微鏡：用于細胞染色后觀察分析
實驗步驟
實驗開始前，將試劑盒里的YIJI反應(yīng)液（Reagent C）和YIJI染色液（Reagent D）從－20℃的冰箱里取出，置入冰槽里等待溶化，并避光。然后移取xx毫升YIJI染色液（Reagent D）到1.5毫升離心管，加入xx微升YIJI反應(yīng)液（Reagent C），充分混勻后，標(biāo)記為YIJI染色工作液，室溫下，置入暗室。然后進行下列操作：
操作一：細胞載玻片染色
一、樣本固著處理
- 取出待測的細胞載玻片
- 小心加上xx微升YIJI清理液（Reagent A）在載玻片上，鋪滿整個樣品表面
- 小心移去載玻片上的YIJI清理液（Reagent A）
- 小心加上200微升YIJI固著液（Reagent B），鋪滿整個樣品表面
- 室溫下，孵育2分鐘
- 小心移去載玻片上的YIJI固著液（Reagent B）
- 小心加上xx微升YIJI清理液（Reagent A），清洗樣品表面
- 小心移去載玻片上的YIJI清理液（Reagent A）
- 重復(fù)實驗步驟7至8一次
二、樣本染色處理
- 小心加上xx微升YIJI染色工作液，鋪滿整個載玻片樣品表面
- 在37℃恒溫培養(yǎng)箱孵育15分鐘；或直至可見紫紅色（注意：避免光照）
- 小心移去載玻片上的YIJI染色工作液
- 室溫下，加上xx微升YIJI清理液（Reagent A），清洗樣品表面
- 小心移去載玻片上的YIJI清理液（Reagent A）
- 樣本復(fù)染處理（選擇步驟）
- 樣本復(fù)染處理（甲基綠）
- 放上蓋玻片或封片
- 即刻在一般光學(xué)顯微鏡下觀察：陽性細胞呈現(xiàn)紫紅色，背景黃色，核為綠色
操作二：24孔細胞培養(yǎng)板染色
一、樣本固著處理
1．小心抽去24孔細胞培養(yǎng)板里的培養(yǎng)液
2．每孔加入xx微升YIJI清理液（Reagent A），清洗生長中的細胞表面
3．小心抽去每孔里的YIJI清理液（Reagent A）
4．每孔加入xx微升YIJI固定液（Reagent B），覆蓋整個生長表面
5．在室溫下孵育2分鐘
6．小心抽去YIJI固定液（Reagent B）
7．每孔加入xx微升YIJI清理液（Reagent A），清洗細胞表面
8．小心抽去YIJI清理液（Reagent A）
9．重復(fù)實驗步驟7和8兩次
二、樣本染色處理
- 小心加入xx微升YIJI染色工作液，覆蓋整個生長表面
- 在37℃恒溫培養(yǎng)箱孵育15分鐘；或直至可見紫紅色（注意：避免光照）
- 小心抽去YIJI染色工作液
- 小心加入xx微升YIJI清理液（Reagent A）
- 室溫下孵育2分鐘
- 小心抽去YIJI清理液（Reagent A）
三、 樣本復(fù)染處理（選擇步驟）
- 樣本復(fù)染處理（甲基綠）
- 小心加入xx微升YIJI清理液（Reagent A）
- 即刻在一般光學(xué)顯微鏡下觀察：陽性細胞呈現(xiàn)紫紅色，背景黃色，核為綠色
注意事項
- 本產(chǎn)品為50次操作（細胞載玻片）和25次（1個24孔板）操作
- 操作時，須帶手套
- YIJI染色工作液配制后，即刻使用，不得超過1小時
- YIJI染色工作液根據(jù)需要配制，每毫升，可以染色5個樣本
- 試劑溶液在樣品表面時，避免有氣泡存在，同時確保鋪滿樣品表面
- 細胞固定建議不要超過2分鐘，以免酶活性降低
- 如果樣品中酶活性較低，細胞染色可以延長至45分鐘
- 細胞染色注意不要過度
- 直接封片處理，不要使用有機溶劑（乙醇、二甲苯等），否則會使染色褪色
- 細胞染色完成后，即刻進行光學(xué)顯微鏡觀察
- 本公司提供系列組織細胞酶活性染色試劑產(chǎn)品
質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
- 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
- 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定顯色清晰