百螢課堂之肌動(dòng)蛋白的染色方案

時(shí)間：2023/11/22閱讀：66

肌動(dòng)蛋白是形成微絲的高度保守的蛋白質(zhì)家族，由于其在真核細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)含量豐富，在微摩爾濃度范圍內(nèi)，肌動(dòng)蛋白參與的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用比任何其他已知蛋白質(zhì)都要多。鬼筆環(huán)肽的熒光衍生物已被證明在定位固定細(xì)胞和組織中的肌動(dòng)蛋白絲以及在體外觀察單個(gè)肌動(dòng)蛋白絲方面非常有用。

肌動(dòng)蛋白具有從其單體狀態(tài)聚合成絲狀肌動(dòng)蛋白（F-肌動(dòng)蛋白）的特別能力。F-肌動(dòng)蛋白和調(diào)節(jié)蛋白之間的相互作用迅速組裝和分解肌動(dòng)蛋白絲，將其組織成肌動(dòng)蛋白束和細(xì)胞骨架網(wǎng)絡(luò)。這些高階結(jié)構(gòu)為多種細(xì)胞過(guò)程提供必要的結(jié)構(gòu)支持，包括細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、胞質(zhì)分裂、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、極性和細(xì)胞形狀、基因調(diào)控和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。因?yàn)榧?dòng)蛋白在許多生物過(guò)程中是不能缺少的，所以研究中必須使用工具（肌動(dòng)蛋白特異性抗體和鬼筆環(huán)肽衍生染色劑）來(lái)觀察這些肌動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)。

圖1.核藍(lán)DCS1死細(xì)胞染料（貨號(hào)17548）

圖2.MitoLite線粒體綠色熒光探針（貨號(hào)22675）

圖3.核藍(lán)DCS1死細(xì)胞染料（貨號(hào)23125）

圖4.復(fù)合圖片

熒光合成頭像。使用MitoLite線粒體綠色熒光探針（貨號(hào)22675）對(duì)活Hela細(xì)胞進(jìn)行染色并成像。在4%甲醛中固定后，用核藍(lán)DCS1死細(xì)胞染料（貨號(hào)23125）和核藍(lán)DCS1死細(xì)胞染料（貨號(hào)17548）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色。

肌動(dòng)蛋白染色方案

以下是鬼筆環(huán)肽-iFluor 488標(biāo)記（貨號(hào)23115）對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞中的F-肌動(dòng)蛋白進(jìn)行染色的示例方案。

注意：

1.鬼筆環(huán)肽是有毒的，應(yīng)小心處理；

2.在適當(dāng)條件下儲(chǔ)存時(shí)，鬼筆環(huán)肽-iFluor綴合物可穩(wěn)定至少6個(gè)月，如果不立即使用，請(qǐng)將它儲(chǔ)存在-20℃以下，避光并避免凍融循環(huán)。

材料：

1.鬼筆環(huán)肽-iFluor 488標(biāo)記（貨號(hào)23115）

2.PBS緩沖液

3.3.0-4.0%無(wú)甲醛甲醇

4.牛血清蛋白

5.細(xì)胞培養(yǎng)

方案如下：

1.將鬼筆環(huán)肽-iFluor488標(biāo)記小瓶加熱至室溫，并在打開(kāi)前短暫離心。

2.將30uL 1000X 鬼筆環(huán)肽-iFluor488標(biāo)記DMSO溶液添加到1mL含1%牛血清蛋白中，制備1X 鬼筆環(huán)肽-iFluor488標(biāo)記工作溶液，并將溶液充分混合。這使得染色溶液足以用于10個(gè)孔，每孔100uL。將未使用的1000X鬼筆環(huán)肽-iFluor488標(biāo)記DMSO庫(kù)存溶液等分并在適當(dāng)?shù)臈l件下儲(chǔ)存。

注意：

1.不同細(xì)胞類(lèi)型的染色可能有所不同。為了獲得好的性能，應(yīng)相應(yīng)地制備鬼筆環(huán)肽結(jié)合物工作溶液的濃度。

2.將細(xì)胞在含 3.0 - 4.0% 無(wú)甲醛甲醇的牛血清蛋白溶液中室溫固定 10 至 30 分鐘。避免使用任何含有甲醇的固定劑，因?yàn)榧状紩?huì)在固定過(guò)程中破壞肌動(dòng)蛋白。

3.小心吸出固定液。

4.在牛血清蛋白中沖洗固定細(xì)胞2-3次。

5.用牛血清蛋白中的 10 mM 乙醇胺淬滅過(guò)量的甲醛 5 分鐘。

6.在 96 孔板中，向細(xì)胞中添加 100 μL/孔的鬼筆環(huán)肽-iFluor488標(biāo)記工作溶液。在室溫下將細(xì)胞染色 20 至 90 分鐘。

7.用牛血清蛋白輕輕沖洗細(xì)胞 2 至 3 次，以去除多余的鬼筆環(huán)肽結(jié)合物。

8.使用配備適當(dāng)濾光片組的熒光顯微鏡觀察細(xì)胞。鬼筆環(huán)肽-iFluor488標(biāo)記需要 FITC 濾光片組才能可視化。

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