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上海斯邁歐分析儀器有限公司
主營產品： 氣相色譜、液相色譜、氣質聯用儀、液質聯用儀、原子吸收光譜儀、紫外分光光度計 |
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血漿藥物定量分析所需的高速、超高靈敏度和耐用性
2023-2-28 閱讀(53)
摘要本文介紹了安捷倫 1200 系列高分離度快速液相色譜儀（RRLC）配合安捷倫 6460A 三重四級桿串聯質譜儀在人血漿生物分析中的應用。高通量分析表現在：待測藥物和內標物都能夠在色譜中于 1 分鐘內洗脫。超高靈敏度表現在：線性范圍涵蓋了人體血漿微劑量水平藥代動力學研究的典型濃度范圍（1–500 pg/mL 血漿濃度）。耐用性和重現性表現在：在上述濃度范圍，5 天之內通過該LC/MS 系統可分析超過1000 個血漿樣品。
引言使用 LC/MS 定量分析生理樣本如血漿和血清中的藥物，可以認為是藥物發現中藥代動力學（PK）研究的特征。通過 LC/MS分析得到的 PK 圖線提供了候選藥物的生物利用率和半衰期信息，以便比較并選出先導化合物用于進一步研究。制藥行業需要靈敏度高、選擇性好、耐用性強的分析方法，同時還應具有高通量，以便快速獲得這些信息并迅速作出判斷。由于由體外實驗或動物實驗的 PK 數據外推得到的人體劑量數據常常具有誤導性，出現了“first-in-human trial"（人體試驗，即人體微劑量試驗）的概念，因而對生物分析的靈敏度設置了更嚴格的要求，即人體微劑量水平實驗的藥物用量必須要低于動物或體外實驗模型中預期治療劑量的1/1001–8。目的為證實安捷倫 1200 系列高分離度快速液相色譜（RRLC）與安捷倫 6460A 三重四級桿串聯質譜聯用系統的高通量、超高靈敏度和耐用性而設計了本實驗。人血漿中添加藥物的濃度設定在人體微劑量水平研究的典型范圍（1–500 pg/mL 血漿濃度）。在隨后的血漿檢測中，五個工作日內完成了包含 1000 多個樣品的分析序列（例如每天進樣 200 次）。每天的分析序列之后都用血漿中藥物的系列標樣來評估系統性能。
實驗儀器• 安捷倫 1200 系列 RRLC 系統，包括 SL二元泵、微量真空脫氣機 、SL 柱溫箱和SL 自動進樣器。• 安捷倫 6460A 質譜儀• 安捷倫 20 通多用途真空處理站• 安捷倫 SampliQ 優化聚合物技術（OPT）萃取柱（30 mg）• 安捷倫 ZORBAX C18 Eclipse Plus 色譜柱 2.1 mm × 50 mm，1.8 µm• 安捷倫 Mass Hunter 工作站軟件，用于儀器控制、數據采集及數據處理LC 方法操作條件流動相 A 水 [0.1% 甲酸（FA）]流動相 B 乙腈（ACN）（0.1 % FA）梯度設置 t (min) %B0 300.1 300.95 601 601.01 901.20 901.21 30流速 0.8 mL/min柱溫 40 °C停止時間 1.5 min梯度平衡時間 2.5 min進樣體積 8 µL洗針 10 s，乙腈/水 60:40 v/v(0.1% TFA)
MS 方法操作條件掃描模式 采用 MRM MasshunterOptimizer 軟件獲得如表 1 中所示的優化條件。離子化模式 結合安捷倫噴射流技術的ESI 正離子模式干燥氣溫度 300 °C干燥氣流速 11 L/min霧化器壓力 20 psi毛細管電壓 2000 V鞘氣溫度 400 °C鞘氣流速 12 L/min噴嘴電壓 0 V化學品人體血漿以及所有標準化學品（去甲替林、曲米帕明、甲酸（FA）購于 Sigma-Aldrich 公司（德國）。HPLC級水購自 Burdick & Jackson 公司（美國），HPLC 級乙腈和甲醇購自 Merck 公司（德國）。血漿檢測校正標樣：10 µL 去甲替林的參比標樣（溶于乙腈/水 = 70:30，v/v）添加到 190 µL 人血漿中，用來配制空白溶液和在1 - 500 pg/mL 范圍內的 6 個濃度的標樣溶液，添加 400 µL 2% 甲酸和 20 µL 曲米帕明內標溶液，渦旋混勻。安捷倫 SampliQ OPT 固相萃取柱（30 mg）用 1 mL 甲醇和 1 mL 水（0.1% 甲酸）活化，加入樣品混合物后先后用 1 mL 0.1%磷酸和 1 mL 5% 乙腈溶液淋洗，然后用200 µL 乙腈/水 = 70:30（ v/v）洗脫，提取物用水稀釋 2 倍，使溶劑組成與流動相初始比例相似。血漿樣本按相同步驟進行處理，4000 rpm 離心 5 分鐘后進樣
結果與討論基質效應和回收率通過新型 SampliQ OPT 填料獲得的基質效應因子和回收率分別參考 Zweigenbaum等提出的公式（1）和（2）9,10。去甲替林標樣配制兩個濃度：500 和 100 pg/mL，添加后的血漿和空白樣本，按前述血漿檢測方法進行提取。空白提取液經緩速氮氣吹干后用參比標樣重新溶解。通過這種方法，就可在已提取添加溶液、提取后空白添加溶液和參考標樣中獲得相同的去甲替林濃度。將樣品以1 µL 體積重復進樣兩次，取平均值進行計算。去甲替林濃度為 500和 100 pg/mL 時回收率分別為 97% 和95%。基質效應因子為 0.8。內標物曲米帕明的結果與之相近。高通量 LC/MS 方法圖 1 是 SPE 提取物的典型 MRM 譜圖。在提取前血漿中去甲替林的濃度為 500 pg/mL。去甲替林和內標物在 1 分鐘內可以洗脫下來，證明該 LC/MS 分析的高通量特性，使用色譜柱交替再生技術還可以獲得更高的通量。使用 RRLC系統，在進行此類 PK 分析時，分析周期時間（包括進樣、樣本分析、柱再生）可以低于1.5 分鐘11。
