高效液相色譜(HPLC)是一種進(jìn)行物質(zhì)分離、鑒定和定量的分析方法。與其它通常采用梯度模式的各種生物聚合物HPLC(離子交換、疏水相互作用和反相色譜)不同，SEC(尺寸排阻色譜法)通常采用等度方法。
尺寸排阻色譜法
尺寸排阻色譜法(SEC)包括凝膠滲透色譜法(GPC)和凝膠過(guò)濾色譜法(在含水條件下實(shí)行的一種特殊SEC法)，是利用球形顆粒多孔基質(zhì)作為固定相的一種分析方法。小分子能夠滲透到篩孔中并被截留。與此相反，大分子則不能進(jìn)入篩孔，只能以線性流速通過(guò)色譜柱。因此，分子根據(jù)其大小進(jìn)行分離，大分子先從色譜柱中洗脫出來(lái)，而后才是小分子從色譜柱中洗脫出來(lái)。
SEC是一種常用于生物聚合物的分離方法。目前的應(yīng)用領(lǐng)域如下：
測(cè)定分子量，例如抗體免疫球蛋白G。
作為一個(gè)研究構(gòu)象變化的工具用于下游加工(后續(xù)加工和產(chǎn)品凈化)。
特殊應(yīng)用：用于肽和蛋白質(zhì)混合物的自動(dòng)化樣品制備的SEC限制介入色譜柱。
幾十年來(lái)，生物制藥在醫(yī)藥市場(chǎng)上已經(jīng)占據(jù)了重要地位。在這些生物制藥產(chǎn)品中，有醫(yī)藥用酶、、各種激素——如胰島素、依泊汀或生長(zhǎng)激素、單克隆抗體(mAbs)和生物工程疫苗。
SEC分析是下游加工中的標(biāo)準(zhǔn)方法，用于通過(guò)重組生產(chǎn)治療性蛋白質(zhì)和抗體來(lái)確定生物制造期間靶分子的純度和聚集狀態(tài)。
確定分子量間的差異來(lái)檢測(cè)污染物和聚合物是基于高純洗脫液的使用，高純洗脫液不會(huì)與固相發(fā)生任何反應(yīng)。
SEC所需特殊質(zhì)量的水可以從各個(gè)制造商處購(gòu)買，或者直接使用艾柯實(shí)驗(yàn)室純化水系統(tǒng)在現(xiàn)場(chǎng)按需直接制備。
水的實(shí)驗(yàn)評(píng)估
本文對(duì)重組單克隆抗體進(jìn)行了定性研究，作為SEC分析使用的一個(gè)例子。所使用的解決方案源于我們的內(nèi)部方案。
在上游加工(溶液制備)期間，發(fā)酵培養(yǎng)基(宿主細(xì)胞DNA、宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)、培養(yǎng)基成分，如白蛋白、胰島素和轉(zhuǎn)鐵蛋白)以及微生物和內(nèi)毒素產(chǎn)生的雜質(zhì)和污染物必須在下游加工中減少。這一過(guò)程也是雜質(zhì)的來(lái)源(蛋白酶的加入，蛋白A的泄漏)。mAb產(chǎn)物本身也能形成雜質(zhì)，例如分裂的或聚集的抗體，mAb的脫酰胺或氧化形式或錯(cuò)誤折疊分子，對(duì)此必須進(jìn)行檢測(cè)。
對(duì)于靶蛋白純度的質(zhì)量控制，根據(jù)其分子量分離，采用SEC等方法來(lái)檢測(cè)聚集的抗體。
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