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X-α-gal用作酵母雙雜交系統(tǒng)中藍(lán)白篩選的篩選標(biāo)記
2022-6-15 閱讀(3444)
X-α-gal用作酵母雙雜交系統(tǒng)中藍(lán)白篩選的篩選標(biāo)記
X-α-gal是酵母半乳糖苷酶（MEL1）的顯色底物，MEL1是GAL4酵母雙雜交系統(tǒng)的一個(gè)報(bào)告基因，該基因受GAL4調(diào)控。MEL1編碼的分泌型的α-半乳糖苷酶可水解無色的X-α-gal，形成藍(lán)色產(chǎn)物。MEL1基因激活后，X-α-gal檢測(cè)陽性克隆表達(dá)的α-半乳糖苷酶，陽性克隆直接在含有X-α-gal的固體培養(yǎng)基上呈藍(lán)色。因此無需裂解細(xì)胞，費(fèi)時(shí)費(fèi)力的檢測(cè)β-半乳糖苷酶報(bào)告基因，只需通過藍(lán)白顏色篩選，即可快速和簡便地識(shí)別陽性克隆。X-α-Gal的用途：1. 用于篩選含X-α-半乳糖苷酶基因的陽性酵母或細(xì)菌菌株。在固體培養(yǎng)基上直接檢測(cè)酵母雙雜交相互作用。2. 用于區(qū)分腸桿菌科內(nèi)的不同菌種，以及區(qū)分雙歧桿菌和乳酸菌3. 在組織化學(xué)中用于酶活性的檢測(cè)。X-Gal與X-α-gal不同：X-Gal是E.coli β-半乳糖苷酶（LacZ）的反應(yīng)底物，而X-α-gal是酵母α-半乳糖苷酶（MEL1）的反應(yīng)底物。X-α-gal用作酵母雙雜交系統(tǒng)中藍(lán)白篩選的篩選標(biāo)記。
攜帶MEL1基因的酵母菌株：Y2HGold、Y190、AH190、Y187、PG69-2A
操作說明
一、涂布于預(yù)制平板：
1）溶解24 mg X-α-gal于6 mL DMF，終濃度為4 mg/ mL。
2）涂布200 μL(15 cm) 或者100 μL（10 cm）X-α-gal 儲(chǔ)存液于預(yù)制平板上；
3）置于37℃培養(yǎng)箱至液體被吸收（由于DMF揮發(fā)性低，最長可放4小時(shí)）；
4）將轉(zhuǎn)化細(xì)菌或酵母涂于平板上，于37℃或30℃培養(yǎng)直至藍(lán)色菌落出現(xiàn)。
二、直接加入瓊脂中：
1）溶解60 mg X-α-gal于3 mL DMF，終濃度為20 mg/ mL。
2）將已滅菌瓊脂培養(yǎng)基冷卻至50-55℃；
3）向上述培養(yǎng)基中加入20 mg/ mL X-α-Gal，比例為每升培養(yǎng)基中加入1 mL X-α-Gal溶液。
