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生產的動物組織直接PCR試劑盒(Animal Tissue Direct PCR Kit)可以從鼠尾(mouse tail)、鼠耳(mouse ear)或其它動物組織如口腔取樣棉簽(buccal swabs)、頭發(hair shafts)、唾液(saliva)等中快速提取和PCR擴增基因組DNA以用于基因型鑒定等。
本試劑盒能快速消化組織樣品獲得基因組DNA，無需機械破碎、有機萃取、柱純化和DNA沉淀，基因組DNA抽提的過程僅需約20分鐘。
本試劑盒適用于小鼠等的基因型鑒定(genotyping)，大規模生物樣品的高通量PCR篩選(high-through PCR screening)，轉基因篩選(transgene screening)，基因敲除分析(knockout analysis)和測序(sequencing)。
本試劑盒中提供的Easy-Load? PCR Master Mix (Green, 2X)中含有2X Taq DNA Polymerase，2X PCR Buffer，2X dNTP和2X上樣緩沖液，只需加入適量引物、模板和水即可進行PCR擴增，大大簡化了PCR操作，減少了PCR操作過程中可能導致的污染。PCR完成后可以直接上樣電泳，無需再添加上樣緩沖液。
使用本試劑盒進行PCR檢測時僅需極少量的樣品就能完成目的基因的擴增和分析。
使用本試劑盒提取的小鼠尾巴基因組DNA直接PCR的效果可參照圖1。

圖1. 本試劑盒提取的小鼠尾巴基因組DNA直接PCR后的電泳圖。PCR反應使用的引物是根據小鼠GAPDH和HSP70基因序列進行設計的，泳道1(GAPDH)和2(HSP70)的PCR產物大小分別為299bp和403bp。M, marker。

對于20微升的PCR反應體系，本試劑盒的兩種包裝分別可用于100個或500個樣品的直接PCR反應。
包裝清單：

保存條件：
-20℃保存，一年有效。DNA Extraction Solution和Stop Solution可以4℃保存，3個月內有效。
注意事項：
使用本試劑盒消化小鼠尾巴或其它組織樣品時，一定要確保組織樣品充分浸沒在消化液中。
配制消化液時，DNA Extraction Solution和Enzyme Mix混勻后，應盡快使用，放置太久可能會影響DNA抽提效果。
由于PCR反應非常靈敏，可以擴增目的基因片段超過1000萬倍，在使用Taq酶時請注意避免微量待擴增DNA的污染，并盡量考慮設置不加模板的空白對照以確認是否有待擴增DNA的污染。
本試劑盒中的Easy-Load? PCR Master Mix (Green, 2X)經過15次反復凍融后仍具有和凍融前幾乎相同的PCR擴增效果，但仍宜適當避免過多的反復凍融，并且在使用前，一定要*融化，并上下顛倒輕輕混勻后才能使用，并盡量避免起泡。
本產品僅限于專業人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內。

為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用說明：
1. 小鼠尾巴、動物組織、頭發或唾液基因組DNA的提取
a. 消化液的配制：按照樣本數量配制消化液，具體配制方法如下：

注：消化液需現配現用，并需要在充分混勻后使用。
b. 不同組織樣品基因組DNA的提取。
(a) 新鮮或凍存的小鼠尾巴：實驗前用70%的乙醇沖洗剪刀和鑷子。剪取0.2-1cm的小鼠尾尖置于上述配制好的100μl消化液中，需確保小鼠尾巴*浸沒在溶液中(一般情況下，重量約為15mg的1cm長的小鼠尾尖剛好能浸沒在含有100μl消化液的PCR管中，小鼠尾巴的重量不宜超過15mg)。對于新鮮的小鼠尾巴，建議盡量在剪下鼠尾后30分鐘內進行基因組DNA抽提，否則宜盡快冷凍存放。
(b) 頭發：實驗前用70%的乙醇沖洗剪刀和鑷子。剪除頭發的多余部分，僅需保留頭發的根部區域并將其置于上述配制好的100μl消化液中，每次提取只需一根帶根部的頭發。
(c) 唾液：吸取10μl的唾液加入上述配制好的100μl消化液中，渦旋或移液槍吹打混勻。
c. 將樣品置于55℃水浴或PCR儀，孵育15分鐘。
d. 將樣品置于95℃水浴或PCR儀，孵育5分鐘(孵育結束后組織未*消化屬于正常現象，不會影響試劑盒的檢測效果)。
e. 向上述樣品中加入100μl的Stop Solution，渦旋混勻。
f. 將上述提取樣品置于-20℃或4℃保存或立即進行PCR檢測(若需長期保存樣品，應將未消化的組織去除或將提取物轉移到新的離心管中。大部分情況下，提取物4℃能保存至少1個月，-20℃至少能保存一年)。
2. PCR擴增
a. PCR反應體系的設置：
(a) 融解并混勻PCR反應所需的各種溶液。將Easy-Load? PCR Master Mix (Green, 2X)置于冰浴上或冰盒內。
(b) 參考下表在冰浴上配制PCR反應體系：

(c) 用移液器輕輕吹打混勻或輕微Vortex混勻，室溫離心數秒，使液體積聚于管底。
(d) 如果所使用的PCR儀有熱蓋則省略本步驟。如果PCR儀沒有熱蓋，則在管內滴入一滴(e) 把配制好的PCR反應體系置于PCR儀上，開始PCR反應。
b. PCR反應參數的設置可以參考如下示例：

3. 瓊脂糖凝膠電泳
PCR反應結束后直接上樣進行瓊脂糖凝膠電泳。

常見問題：
1. PCR產物少或沒有目的條帶。
a. 組織提取物中的污染物抑制了PCR反應。為檢測抑制物，可用等體積混合的DNA Extraction Solution和Stop Solution，同時用DNA對照或已知數量的模板(100-500 copies)進行PCR反應。
b. 組織消化不夠充分。可適當延長55℃消化時間或適當增加Enzyme Mix的使用量。
c. Enzyme Mix未被*滅活。適當延長消化產物在95℃的孵育時間。
d. 引物設計不佳是PCR過程中最常見的問題。請選擇適當的引物設計軟件進行引物設計，注意引物的GC含量、二級結構、二聚體、退火溫度、長度、特異性等方面的問題。在加入酶切位點等的引物中，一定要注意加入酶切位點等后整條引物的GC含量、二級結構、二聚體、退火溫度、長度、特異性等方面的問題。在原有引物效果不佳的情況并且陽性對照引物可以正常工作的情況下，可以考慮更換引物。
e. 待擴增片段GC含量偏高。GC含量較高的情況下PCR會變得相對比較困難，此時可以使用適合擴增高GC含量DNA段的GC-rich buffer，并相應地根據GC-rich buffer的要求或說明調整PCR反應參數的設置。
f. 長片段擴增。盡管Taq DNA polymerase可以擴增最長達8kb的DNA段，但大多數時候比較適合擴增2-3kb以下的片段，更長片段的擴增推薦使用其它更適合長片段擴增的DNA聚合酶。
g. PCR反應設置時在室溫進行容易導致非特異性條件。推薦在冰浴上設置PCR反應。
h. 由于引物存在一定的二級結構或存在一定的引物二聚體，或引物偏短，導致退火效果不佳。此時可以采用Touch down等方法進行退火，通常采用從65℃逐步緩慢降溫到55℃或50℃的方法，使退火更加充分。
i. 退火溫度不佳，需要優化。如果有溫度梯度PCR儀，則可以設置退火的溫度梯度，摸索退火的最佳溫度。如果沒有溫度梯度PCR儀，則可以通過多次PCR反應摸索最佳的退火溫度。
j. 延伸時間不足。可按照每1kb片段延伸1分鐘進行設置，對于較難擴增的片段可以設置為每1kb片段延伸1.5-2分鐘。
k. 待擴增片段GC含量較高或長度較長，變性不夠充分。可以調節起始變性條件至95℃ 1min甚至95℃ 2-4min。
l. 在不同PCR儀上進行PCR反應，避免有時PCR儀出現問題。
m. 循環數不足，適當延長PCR的循環數。通常循環數最高不必超過40，常用的循環數范圍為25-35。
n. 模板含量太低，適當加大模板量，或采用巢式PCR(nested PCR)或二次PCR。巢式PCR即為在原先設計的PCR引物內側再設計一對PCR引物，然后對第一次PCR產物進行稀釋后再進行一次PCR擴增，這樣一方面可以起到擴增作用，同時也可以從第一次PCR產物中擴增出特異性條帶。二次PCR則為比較簡單地用原有引物對第一次PCR產物進行稀釋后再進行一次PCR擴增，可以起到擴增作用，但不能去除非特異性條帶。
o. 注意設置適當的陽性對照和陰性對照通常會有很大幫助。
2. 組織在孵育后未*消化。
a. 有些組織很難*消化。直接PCR試劑盒不要求組織*消化，部分消化提取的DNA通常也足夠滿足PCR檢測。