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上海雅吉生物科技有限公司
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NAD-蘋(píng)果酸脫氫酶（NAD-MDH）試劑盒使用說(shuō)明書(shū)
2021-6-25 閱讀(319)
測(cè)定意義：
MDH （EC 1.1.1.37）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，線粒體中 MDH 是 TCA 循環(huán)的關(guān)鍵酶之一，催化蘋(píng)果酸形成草酰乙酸；相反，胞漿中 MDH 催化草酰乙酸形成蘋(píng)果酸。草酰乙酸是重要的中間產(chǎn)物， 連接多條重要的代謝途徑。因此，MDH 在細(xì)胞多種生理活動(dòng)中扮演著重要的角色，包括線粒體的能量代謝、 蘋(píng)果酸-天冬氨酸穿梭系統(tǒng)、活性氧代謝和抗病性等。根據(jù)不同的輔酶特異性，MDH 分為 NAD-依賴的 MDH 和 NADP-依賴的MDH，細(xì)菌中通常只含有 NAD-MDH，在真核細(xì)胞中，NAD-MDH 分布于細(xì)胞質(zhì)和線粒體中。
測(cè)定原理：
NAD-MDH 催化NADH 還原草酰乙酸生成蘋(píng)果酸，導(dǎo)致 340nm 處光吸收下降。
需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板和蒸餾水。
試劑的組成和配制：
試劑一、提取液 100 mL×1 瓶，在 4℃保存； 試劑二、液體 20 mL×1 瓶，在 4℃保存；
試劑三、粉劑×1 瓶，-20℃保存；
樣本測(cè)定的準(zhǔn)備：
1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：
細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量
（104 個(gè)）：試劑一體積（mL）為 1000~2000：1 的比例（建議 2000 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL試劑一），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。
組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 試劑一），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。
2、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。
測(cè)定步驟：
1、 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm，蒸餾水調(diào)零。
2、檢測(cè)工作液的配制：用時(shí)在試劑三中加入 19mL 試劑二和 0.5mL 蒸餾水，充分混勻待用； 用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。；
3、測(cè)定前將檢測(cè)工作液在 37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）水浴 10min 以上。
4、在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 5μL 樣本和 195μL 工作液，混勻后立即記錄 340nm
處 20s 時(shí)的吸光值 A1 和 1min20s 后的吸光值 A2，計(jì)算 ΔA=A1-A2。
注意：若 A1-A2 大于 0.5，需將樣本用提取液稀釋，使 A1-A2 小于 0.5，可提高檢測(cè)靈敏度。計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。
NAD-MDH 活力單位的計(jì)算：
a. 用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下
1、血清（漿）NAD-MDH 活力的計(jì)算
單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。
NAD-MDH（nmol/min/mL）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷V 樣÷T=6430×ΔA 2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 NAD-MDH 活力的計(jì)算:
（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算：
單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。
NAD-MDH（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=6430×ΔA÷Cpr
（2） 按樣本鮮重計(jì)算：
單位的定義：每 g 組織每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。
NAD-MDH（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷（W× V 樣÷V 樣總）÷T
=6430×ΔA÷W
（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：
單位的定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。NAD-MDH（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷（2000×V 樣÷V 樣總）÷T=3.215×ΔA V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d： 比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.005 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T： 反應(yīng)時(shí)間，1 min；W：樣本質(zhì)量，g；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；2000：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，2000 萬(wàn)。
b. 用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下
1、血清（漿）NAD-MDH 活力的計(jì)算
單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。
NAD-MDH（nmol/min/mL）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷V 樣÷T=12860×ΔA 2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 NAD-MDH 活力的計(jì)算:
（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算：
單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。
NAD-MDH（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=12860×ΔA÷Cpr
（2） 按樣本鮮重計(jì)算：
單位的定義：每 g 組織中每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。
NAD-MDH（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷（W× V 樣÷V 樣總）÷T
=12860×ΔA÷W
（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：
單位的定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。NAD-MDH（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷（2000×V 樣÷V 樣總）÷T=6.43×ΔA V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d： 96 孔板光徑，0.5cm；V 樣：加入樣本體積，0.005 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL； T：反應(yīng)時(shí)間，1 min；W：樣本質(zhì)量，g；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；2000：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，2000 萬(wàn)。
