用途 本試劑盒采用實(shí)時(shí)熒光 RT-PCR 方法檢測(cè)禽組織、分泌物和排泄物中所有亞型的禽流感病 毒（AIV）的 RNA，適用于 AIV 的檢測(cè)、診斷和流行病學(xué)調(diào)查。

原理 利用離心柱內(nèi)硅基質(zhì)膜提取樣品總 RNA，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以 RNA 為模板，以 引物為起點(diǎn)合成與 RNA 模板互補(bǔ)的 cDNA 鏈。在熱啟動(dòng) Taq 酶的作用下，經(jīng)高溫變性、中溫退火 及延伸的循環(huán)，使特異 DNA 片段的拷貝數(shù)放大一倍，經(jīng)熒光素標(biāo)記的探針與擴(kuò)增的 DNA 雜交，利 用 Taq 聚合酶的 5'→3'外切活性，使熒光探針的報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，發(fā)出特異性熒光信號(hào)，利 用熒光 PCR 儀檢測(cè)特異性熒光信號(hào)，根據(jù)樣品 Ct 值的大小及擴(kuò)增曲線的形成情況判定結(jié)果。

試劑盒組成

保存期 本產(chǎn)品有效期為 12 個(gè)月。

需要自備的器材

1．儀器：分析天平、離心機(jī)、熒光 PCR 擴(kuò)增儀、組織研磨器、-20 ℃冰箱、可調(diào)移液器（2 µL、20

µL、200 µL、1000 µL）。

2．耗材：熒光 PCR 反應(yīng)管、眼科剪、眼科鑷、生理鹽水、1.5 mL 經(jīng)焦碳酸二乙酯（DEPC）水 處理的滅菌離心管、吸頭（10 µL、200 µL、1000 µL）、滅菌雙蒸水。

使用注意事項(xiàng)

1．所有接觸病料的物品均應(yīng)合理處置，以免污染實(shí)驗(yàn)室。

2．PCR  整個(gè)試驗(yàn)分配液區(qū)、模板提取區(qū)、擴(kuò)增區(qū)。流程順序?yàn)榕湟簠^(qū)→模板提取區(qū)→擴(kuò)增區(qū)。嚴(yán) 禁器材和試劑倒流。

3．所有試劑應(yīng)在規(guī)定的溫度儲(chǔ)存。-20℃保存的各試劑管使用前應(yīng)*融化，8000 rpm 離心 15 s， 使液體全部沉于管底，放于冰盒中，吸取液體時(shí)移液器吸頭盡量在液體表面層吸取，使用后立 即放回-20 ℃。

4．在 RNA 提取過程中，避免 RNA 酶污染，盡量縮短操作時(shí)間。

5．注意防止試劑盒組分受污染。不要使用超過有效期限的試劑，試劑盒之間的成分不要混用。

6．嚴(yán)格遵守操作說明可以獲得的結(jié)果。操作過程中移液、定時(shí)等全部過程必須。

7．反應(yīng)體系應(yīng)在特定配液區(qū)或者超凈工作臺(tái)中配制，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格控制污染。

8．反復(fù)凍融試劑將減低檢測(cè)靈敏度，本試劑盒應(yīng)在 3 次內(nèi)用完，請(qǐng)嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。

樣品制備

1 樣品采集：病死或撲殺禽，取喉氣管、腦、胸肌、心肌和肺等組織；待檢活禽，用棉拭子取呼吸 道分泌物或排泄物，置于 50%甘油生理鹽水中。2～8 ℃保存，送實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。（要求送檢病料新鮮， 嚴(yán)禁反復(fù)凍融。）

2  樣品處理：每份樣品分別處理。

2.1 組織樣品處理：每份組織分別從三個(gè)不同的位置稱取樣品約 1g，用手術(shù)剪剪碎混勻后取 0.05 g 于研磨器中研磨，加入 1.5 mL 生理鹽水繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5 mL 滅菌離心管中，8000 rpm 離心 2 min，取上清液 100 µL 于 1.5 mL 滅菌離心管中。

2.2  全血樣品處理：待血凝后取血清 100 µL，置 1.5 mL 滅菌離心管中。

2.3 陽(yáng)性對(duì)照處理：取陽(yáng)性對(duì)照 100 µL，置 1.5 mL 滅菌離心管中。

2.4  陰性對(duì)照處理：取陰性對(duì)照 100 µL，置 1.5 mL 滅菌離心管中。

操作步驟

1  病毒 RNA 的提取

1.1  取已處理的樣品、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，分別加入裂解液 600 µL，充分顛倒混勻，室溫靜置 3～

5 min。

1.2  將液體吸入吸附柱中（吸附柱要套上收集管，吸取液體時(shí)盡量不要吸到懸浮雜質(zhì)，以免離心時(shí) 堵塞吸附柱），13000 rpm 離心 30 s。

1.3  棄去收集管中液體，加入 600 µL 洗液，13000 rpm 離心 30 s。

1.4 重復(fù)步驟 1.3。

1.5 棄去收集管中液體，13000 rpm 空柱離心 2 min，以除去殘留的洗滌液。

1.6  將吸附柱移入新的 1.5 mL 離心管中，向柱中央加入洗脫液 50 µL，室溫靜置 1 min，13000 rpm

離心 30 s，離心管中液體即為模板 RNA。

2  實(shí)時(shí)熒光 RT-PCR 操作

設(shè)被檢樣品、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照總和為 N，則反應(yīng)體系配制如下： 試劑 體系

無菌無核酸酶水 2.7（N+1）µL

RT-PCR 反應(yīng)液 10（N+1）µL

酶混合液 0.4（N+1）µL

熒光探針 1.9（N+1）µL

將以上配制的反應(yīng)體系充分混勻后，分裝每個(gè)反應(yīng)管中各 15 µL。

分別取 5 µL 模板 RNA，加入相應(yīng)反應(yīng)管中，混勻并作好標(biāo)記，在熒光 PCR 儀上進(jìn)行以下反應(yīng)：

45 ℃ 15 min，95 ℃ 1min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s，在每個(gè)循環(huán)第二步（60℃ 35s）收集熒光信號(hào)，共

40 個(gè)循環(huán)。（報(bào)告基團(tuán)“FAM”，淬滅基團(tuán)“None”）。

結(jié)果判定

1 結(jié)果分析條件設(shè)定 閾值設(shè)定原則：閾值線設(shè)定于剛好超過陰性對(duì)照擴(kuò)增曲線的點(diǎn)。不同儀器可根據(jù)儀器噪音

情況進(jìn)行調(diào)整。

2  結(jié)果描述及判定

陽(yáng)性對(duì)照 Ct 值≤30 并出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線，陰性對(duì)照無 Ct 值并且無特定擴(kuò)增曲線，實(shí)驗(yàn)結(jié)果成 立；被檢樣品 Ct 值≤30 并出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線為 AIV 陽(yáng)性；被檢樣品 30＜Ct＜37 并出現(xiàn)特定的擴(kuò) 增曲線，需重新取樣提取 RNA，擴(kuò)增后進(jìn)行結(jié)果判定，如仍是可疑，可判定為陽(yáng)性；被檢樣品 Ct 值≥37 時(shí)，超過本方法檢測(cè)靈敏度范圍，判定為陰性；對(duì)于某些未呈現(xiàn) S 型曲線，但本底較高的樣 品，應(yīng)為陰性。