安捷倫液相色譜儀由高壓液體泵、檢測器及液相色譜柱等三部分組成，其中液相色譜柱的正確安裝和使用，是液相色譜工作的關鍵；也是液相色譜工作者獲得正確可靠的實驗數據的必經之路。 *：安捷倫液相色譜儀安裝條件 一、環境要求： 1、溫度：15～30℃ 2、日溫差：±3℃ 3、相對濕度：20%～85% 4、地面：平滑、不易起塵 5、安裝場所： 無震動、周圍無腐蝕性介質、無電磁場干擾，操作臺縱深尺寸60cm以上，避免空調直吹風，避免直射陽光。 6、推薦液相色譜儀工作臺：長2米、寬0.8米，承重大于80公斤。建議離墻距離0.3米以上。 一般在安裝的實際空間上，還要考慮： 與其它儀器間距大于60cm，儀器后面板應留有不小于50cm的空間，前面板至操作臺邊緣距離不小10cm；儀器安裝平穩牢固，接入了UPS電源，儀器外殼與地線連接。 二、電源要求： 1、單相交流220V，(+5%～-10%)，50～60Hz，有單獨的良好接地。 2、若電壓不穩，需配置穩壓電源，功率大于2.5千瓦。 3、準備1個合格的萬用接線板，總數不小于5個扁平三角接線插座。 4、斷電續電能力：斷電情形，設備能持續運行1小時以上。 5、接地：安裝場所應有可靠接地線裝置 三、溶劑要求： 1、二次重蒸餾水，1000毫升以上(建議用0.45微米水相濾膜過濾)。 2、乙腈或甲醇(色譜純或優級純)，1500毫升以上(建議用0.45微米有機相濾膜過濾)。 四、操作系統：Windows XP 操作系統 硬件要求：內存不低于2G；硬盤不低于160G；配有網絡適配器(2個網卡)；帶光區驅動 第二、安捷倫液相色譜儀安裝方法： 1、液相色譜柱的結構： a、空柱由柱接頭、柱管及濾片組裝而成。 柱接頭采用低死體積結構，柱接頭是兩端螺紋組件，一端是為7/16英寸外螺紋，另一端是3/16英寸的內螺紋(國內外已規范化)。7/16英寸外螺紋與1/4英寸柱管(Φ6.35mm)連接，中間放置壓壞用于密封。3/16英寸的內螺紋與1/16英寸(Φ1.57mm)的連接管連接，中間也放置壓環用于柱接頭的密封。為了盡量減少柱外死體積，在安裝色譜柱時，用Φ1.57mm連接管通過空心螺釘壓環后要盡量插到底，然后再擰緊空心螺釘。壓環被空心螺釘擠壓變形后緊箍在連接管上(連接管通過壓環后露出的管長度應嚴格控制在2.5mm長或其他固定尺寸)。 在兩端柱接頭內，柱管兩端各放置一片不銹鋼濾片(或濾網)，用于封堵柱填料不被流動相沖出柱外而流失。空柱各組件均為316#不銹鋼材質，能耐受一般的溶劑作用。但由于含氯化物的溶劑對其有一定的腐蝕性，故使用時要注意，柱及連接管內不能長時間存留此類溶劑，以避免腐蝕。 b、柱填料： 液相色譜柱的分離作用是在填料與流動相之間進行的，柱子的分類是依據填料類型而定。 正相柱：多以硅膠為柱填料。根據外型可分為無定型和球型兩種，其顆粒直徑在3—10 μm的范圍內。另一類正相填料是硅膠表面鍵合—CN，-NH2等官能團即所謂的鍵合相硅膠。 反相柱：主要是以硅膠為基質，在其表面鍵合十八烷基官能團(ODS)的非極性填料。也有無定型和球型之分。 常用的其他的反相填料還有鍵合C8、C4、C2、苯基等，其顆粒粒徑在3—10 μm之間。 2，色譜柱的安裝： a、拆開柱包裝盒，確認色譜柱的類型、尺寸、出廠日期以及柱內貯存的溶劑。 b、擰下柱兩端接頭的密封堵頭放回包裝盒供備用。 c、 按柱管上標示的流動相流向，將色譜柱的入口端通過連接管與進樣閥出口相連接(如條件允許，建議在柱前使用保護柱)；柱的出口與檢測器連接。連接管是外徑為1.57mm、內徑為0.1-0.3mm的不銹鋼管。連接管的兩端均有空心螺釘及密封用壓環。在接管時一定要設法降低柱外死體積。連接管通過空心螺釘、壓環后盡量用力插到底，然后順時針擰緊空心螺釘，直到擰不動為止，再用扳手繼續順時針擰1/4-1/2圈，切記不要用力過大。如色譜柱通過流動相加壓后有漏液現象，請用扳手繼續順時針擰1/4圈，直至不漏液為止。 第三、液相色譜柱的使用： 色譜柱在使用前，進行柱的性能測試，并將結果保存起來，作為今后評價柱性能變化的參考。但要注意：柱性能可能由于所使用的樣品、流動相、柱溫等條件的差異而有所不同；另外，在做柱性能測試時是按照色譜柱出廠報告中的條件進行(出廠測試所使用的條件是條件)，只有這樣，測得的結果才有可比性。 1、樣品的前處理： a、使用流動相溶解樣品。 b、使用予處理柱除去樣品中的強極性或與柱填料產生不可逆吸附的雜質。 c、使用0.45μm的過濾膜過濾除去微粒雜質。 2、流動相的配制： 液相色譜是樣品組分在柱填料與流動相之間質量交換而達到分離的目的，因此要求流動相具備以下的特點： a、流動相對樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會沉淀在柱中(或長時間保留在柱中)。 b、流動相具有一定惰性，與樣品不產生化學反應(特殊情況除外)。 c、流動相的黏度要盡量小，以便在使用較長的分析柱時能得到好的分離效果；同時降低柱壓降，延長液體泵的使用壽命(可運用提高溫度的方法降低流動相的黏度)。 d、流動相的物化性質要與使用的檢測器相適應。如使用UV檢測器，使用對紫外吸收較低的溶劑配制。 e、流動相沸點不要太低，否則容易產生氣泡，導致實驗無法進行。 f、在流動相配制好后，一定要進行脫氣。除去溶解在流動相中的微量氣體既有利于檢測，還可以防止流動相中的微量氧與樣品發生作用。 3、流動相流速的選擇： 因柱效是柱中流動相線性流速的函數，使用不同的流速可得到不同的柱效。對于一根特定的色譜柱，要追求柱效，使用流速。對內徑為4.6mm的色譜柱，流速一般選擇1ml/min，對于內徑為4.0mm柱，流速0.8ml/min為佳。 當選用流速時，分析時間可能延長。可采用改變流動相的洗滌強度的方法以縮短分析時間(如使用反相柱時，可適當增加甲醇或乙腈的含量)。 注意： a.由于甲醇廉價，對于反相柱推薦使用甲醇體系(必須使用乙腈的場合除外)。 b.對于正相柱推薦使用沸程為30-60℃的石油醚或提純后的己烷作流動相，沒有提純的己烷不得使用。用水使用超純水(電阻率大于18兆歐)，去離子水及雙蒸水中含有酚類雜質，有可能影響分析結果。 c.含水流動相在實驗前配制，尤其是夏天使用緩沖溶液作為流動相不要放置時間過長。加入，防止細菌生長。 d.流動相要求使用0.45 μm濾膜過濾，除去微粒雜質。 e.使用HPLC級溶劑配制流動相，使用合適的流動相可延長色譜柱的使用壽命，提高柱性能。 4、柱性能測試： 啟動液相色譜儀：a、流動相流速設定為1ml/min。 b、UV檢測器波長設定為254nm。 使用出廠測試時使用的流動相組成及測試樣品。 記錄并計算測試結果。 液相色譜儀常見故障及處理方法 液相色譜儀常見故障及處理方法簡析
1、液相色譜儀—氣泡溢出
流動相內有氣泡,關閉泵,打開泄壓閥,打開purg鍵,清洗脫氣,氣泡不斷從過濾器冒出,進入流動相,無論打開purge鍵幾次,都無法清除不斷產生的氣泡。原因過濾器長期沉浸于乙酸銨等緩沖液內,過濾器內部由于霉菌的生長繁殖,形成菌團,阻塞了過濾器,緩沖液難以流暢地通過過濾器,空氣在泵的壓力作用下經過濾器進入流動相。處理過濾器浸泡于5%硝酸溶液中,超聲清洗幾分鐘即可;亦可將過濾器浸泡于5%硝酸溶液中12～36小時,輕輕震蕩幾次,再將過濾器用純水清洗幾次,打開泄壓閥,打開purge鍵清洗脫氣,如仍有氣泡不斷從過濾器冒出,繼續將過濾器浸泡于5%硝酸溶液中,如沒有氣泡不斷從過濾器中冒出,說明過濾器內部的霉菌菌團已被硝酸破壞,流動相可以流暢地通過過濾器。打開泄壓閥,打開泵,流速調至1.0～3.0ml/min,純水沖洗過濾器1小時左右。即可將過濾器清洗干凈。關閉泄壓閥,純甲醇沖洗半小時即可。
2、液相色譜儀—柱壓高原因
(1)緩沖液鹽分如(乙酸銨等)沉積于柱內;
(2)樣品污染沉積。處理對于種情況先用40～50℃的純水,低速正向沖洗柱子,待柱壓逐漸下降后,相應提高流速沖洗,柱壓大幅度下降后,用常溫純水沖洗,之后用純甲醇沖洗柱子30分鐘;對于第二種情況,由樣品的沉積引起污染的C18柱,和純水反向沖洗柱子,然后換成甲醇沖洗,接著用甲醇+異丙醇(4+6)沖洗柱子(沖洗時間的長短由樣品污染的情況而定),再用換成甲醇沖洗,然后用純水沖洗,最后甲醇沖洗正向沖洗柱子30分鐘以上。
3、液相色譜儀—既無壓力指示,又無液體流過
(1)泵密封墊圈磨損;
(2)大量氣泡進入泵體。處理對于種情況,更換密封墊圈;對于第二種情況,在泵作用的同時,用一個50ml的玻璃針筒在泵的出口處幫助抽出空氣。
4、液相色譜儀—壓力波動大,流量不穩定
原因系統中有空氣或者單向閥的寶石球和閥座之間夾有異物,使得兩者不能密封。處理工作中注意觀察流動相的量,保證不銹鋼濾器沉入儲液器瓶底,避免吸入空氣,流動相要充分脫氣。如為單向閥和閥座之間夾有異物,拆下單向閥,放入盛有丙酮的燒杯用超聲波清洗。
5、液相色譜儀—出峰不佳,峰分叉
(1)色譜柱被污染;
(2)柱頭填料塌陷。處理對于種情況,先用純水反向沖洗柱子,然后換成甲醇沖洗,接著用甲醇+異丙醇(4+6)沖洗柱子(沖洗時間的長短由樣品污染的情況而定),再換成甲醇沖洗,然后用純水沖洗,最后甲醇沖洗正向沖洗柱子30分鐘以上。如沖洗后依然出峰不佳,則考慮第二種情況。對于第二種情況,擰開柱頭,檢查柱填料是否硬結或塌陷。去除硬結部分(污染的填料),裝入新填料,滴一滴甲醇,填料下陷,再填,用與柱內徑相同的頂端平滑的不銹鋼桿壓緊,再填平,滴甲醇,再壓緊反復幾次,直至裝滿填平。柱頭用甲醇沖洗干凈,擦凈柱外壁的填料,擰緊柱頭,用純甲醇沖洗30分鐘以上。
6、液相色譜儀—峰面積重復性不佳
(1)進樣閥漏液;
(2)加樣針不到位。
(3)液量不足.
處理對于種情況更換進樣閥墊圈;對于第二種情況保證加樣針插到底,注射樣品溶液后須快速、平穩地從LOAD狀態轉換到INJECT狀態,以保證進樣量的準確。日常工作中,液相色譜儀的保養非常重要,如要注意不要讓空氣進入輸液系統和高壓泵中,儲液器內的溶液如長時間未用應清洗儲液器并更換溶液,每次用完色譜儀后緩沖液要用純水沖洗干凈,防止無機鹽析出或沉積;樣品的前處理也很重要,任何樣品都要盡可能地去除雜質,溶解,盡量減少對色譜柱的污染,以延長色譜柱的使用壽命,同時避免注射過濃的樣品溶液,以免殘留液在進樣閥內析出固體引起堵塞;色譜柱作好標記,用于不同分析目的的色譜柱不要混用等。
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