Caspase 3 活性測(cè)定（FIENA法）檢測(cè)細(xì)胞凋亡
Caspase3 的激活在凋亡過(guò)程的細(xì)胞事件啟動(dòng)中起著重要作用，有證據(jù)表明，在蛋白酶級(jí)聯(lián)切割過(guò)程中，Caspase 3處于核心位置。本法運(yùn)用熒光酶聯(lián)免疫吸附法（flurometric immunosorbent enzyme assay， FIENA）的原理， Caspase3激活后會(huì)作用于其特異的底物：乙酰化天冬氨酸-*-*-天冬氨酰胺（Ac-DEVD），如將Ac-DEVD與熒光素連接（Ac-DEVD-AFC），即會(huì)產(chǎn)生熒光裂解產(chǎn)物AFC，而且caspase3的活性與Ac-DEVD-AFC的分解量或自由熒光產(chǎn)生熒光的強(qiáng)弱成正比。本法可用于各種培養(yǎng)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)研究，而且靈敏度高，特異性強(qiáng)（特異性的抗caspase 3單克隆抗體），與其他已知的caspases無(wú)交叉反應(yīng)。
材料與試劑
1. 20x包被緩沖液 ；
2. 20x抗caspase3抗體；
3. 封閉緩沖液；
4. 孵育緩沖液；
5. 100xDTT；
6. 20x底物Ac-DEVD-AFC；
7. AFC；
8. 陽(yáng)性對(duì)照： 凋亡細(xì)胞U937細(xì)胞裂解液；
9. 微孔板。
操作步驟
1. 樣品制備： 以適當(dāng)方法誘導(dǎo)（如2x106 個(gè)細(xì)胞）凋亡（1-24小時(shí)）。誘導(dǎo)后，以冷PBS洗滌細(xì)胞并離心（300xg）5分鐘，收集細(xì)胞。設(shè)置未經(jīng)誘導(dǎo)的陰性對(duì)照；
2. 重懸細(xì)胞， 加入細(xì)胞裂解液與之作用，冰上1分鐘。 待細(xì)胞裂解后可以于-20°c儲(chǔ)存一周；或直接離心，室溫1分鐘，取細(xì)胞溶解液100μl用于測(cè)定；
3. 包板：用抗Caspase 3 抗體包被液包被微孔板，孵育37℃ 1小時(shí)或4℃過(guò)夜。 用封閉緩沖液于室溫條件下作用30min，以封閉非特異性結(jié)合。棄去封閉緩沖液，并用孵育緩沖液洗三次；
4. 測(cè)定Caspase 3活性：將樣本（細(xì)胞裂解液100μl、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照）加至抗caspase 3 包被MTP的微孔中，37℃孵育1小時(shí)， 棄去未結(jié)合標(biāo)本， 以孵育緩沖液于室溫洗板3 次，每次1min。 加入新鮮配制的Caspase底物溶液， 37℃ 反應(yīng)1~3小時(shí)； 然后進(jìn)行熒光光度檢測(cè)， 激發(fā)波長(zhǎng)400nm， 發(fā)射波長(zhǎng)為505nm。
結(jié)果判斷
Caspase 3的活性與AC-DEVD-AFC的分解量或自由熒光產(chǎn)生熒光的強(qiáng)弱成正比。
注意事項(xiàng)
此法特異性高，可在106 細(xì)胞裂解物中檢測(cè)出5%的凋亡細(xì)胞率。 然而，對(duì)特定樣本中的檢測(cè)下限則隨凋亡過(guò)程的動(dòng)力學(xué)，誘導(dǎo)凋亡的試劑，以及在細(xì)胞總數(shù)中受影響的細(xì)胞數(shù)而異。
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