子科生物報道：堿基編輯技術（Base Editing）是基于CRISPR系統開發的基因組定向修飾技術。該技術由于不需要DNA雙鏈斷裂和外源供體DNA可以實現對目的堿基的精zhun替換，在疾病治療、植物性狀改良等方面具有很大的應用潛力。

中國科學院遺傳與發育生物學研究所高彩霞研究組長期致力于植物基因組編輯技術的創新及應用研究，前期已經在植物中建立了完善的胞嘧啶堿基編輯器（Cytosine Base Editor, CBE）和腺嘌呤堿基編輯器（Adenine Base Editor, ABE）技術體系（Zong et al., Nat. Biotechnol. 2017; Zong et al., Nat. Biotechnol. 2018; Li et al., Genome Biol. 2018），但是發現胞嘧啶堿基編輯器在基因組水平存在脫靶效應（Jin et al., Science 2019）。為解決這一問題，高彩霞研究組通過對人類胞嘧啶脫氨酶（APOBEC3B）蛋白的理性設計，并結合新型的胞嘧啶堿基編輯篩選方法，開發出了新型高精度、高編輯活性的胞嘧啶堿基編輯工具。

研究人員首先在水稻原生質體中建立并優化了基于R-loop的高通量堿基編輯器特異性評估方法。該方法利用CBE作用于單鏈DNA的特性，通過SpCas9的正交蛋白nSaCas9在編輯靶點外的基因組區段誘導R-loop，從而人為制造單鏈DNA（single stand DNA, ssDNA）區域。如果CBE的脫氨活性在這些區域產生脫靶編輯，可以通過高通量測序進行富集檢測。

該工作首先對已報道的5個胞嘧啶堿基編輯器分別通過R-loop方法和全基因組測序（Whole-genome sequencing, WGS）進行特異性檢測，發現R-loop方法與 WGS的結果一致，證明了R-loop方法的可靠性。且該方法與WGS相比，更加快速、便捷和經濟。

在此基礎上，研究人員通過對一系列理性設計的基于人源APOBEC脫氨酶的CBE的特異性進行篩選。以編輯效率高且編輯窗口小的A3Bctd（a truncated APOBEC3B deaminase with enzymatic activity）作為蛋白進化的原始底盤，根據蛋白結構信息預測與其脫氨的催化活性和ssDNA結合能力相關的結構域以及這些結構域中的重要氨基酸殘基，通過理性設計獲得16個單氨基酸替換的CBE變體。通過篩選獲得了靶向效率維持較高且能較顯著降低脫靶效應的7種單個氨基酸突變（R211K, T214V,, R311K, Y313F, D314R, D314H 和 Y315M）。

為了進一步降低CBE的脫靶效應，研究人員將這些單氨基酸突變進行組合創制了9個多氨基酸替換變體，zui終篩選得到了兩種靶向編輯效率較高且特異性顯著增加的CBE變體：A3Bctd-VHM-BE3 和A3Bctd-KKR-BE3。對編輯產物的分析顯示，這兩種變體在編輯窗口內主要產生單個C或者兩個C的替換，顯著提升了編輯的精確性。zui后，通過對150個水稻編輯植株的全基因組測序數據進一步證明了A3Bctd-VHM-BE3 和A3Bctd-KKR-BE3的高特異性。

該工作結合基于結構信息的蛋白理性設計、植物個體全基因組脫靶檢測技術和高通量R-loop脫靶檢測技術，進一步提高了單堿基編輯的精確性，開發出的兩種能保持高編輯效率且無隨機脫靶效應的CBE變體，為基因治療和植物分子設計育種提供了強有力的工具支撐。

相關研究成果結果于2020年7月27日在線發表在Molecular Cell雜志（DOI:10.1016/j.molcel.2020.07.005)。遺傳發育所高彩霞研究組博士生靳帥、費宏源、朱子旭以及微生物所副研究員駱迎峰為本文的共同第1作者；高彩霞研究員與王延鵬青年研究員為本文共同通訊作者；明尼蘇達大學張峰博士，遺傳發育所陳宇航研究員也參與了這項研究。該研究得到了國家轉基因重大科技專項、中國科學院戰略性先導專項A、國家自然科學基金委和中國科學院青促會項目的資助。