冰凍切片線粒體內膜功能（膜電位）熒光測定試劑盒產品說明書

主要用途

冰凍切片線粒體內膜功能（膜電位）熒光測定試劑是一種旨在通過高度敏感的陽離子熒光羰花青染料結合到線粒體基質，其熒光的增強或減弱說明線粒體膜電位的變化，即內膜電負性的增高或降低，來分析冰凍組織樣品線粒體內膜功能的完整性的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種冰凍動物組織線粒體的功能檢測。可以被用于細胞凋亡、信號傳遞、衰老等的研究。產品嚴格無菌，即到即用，活體檢測，操作極為簡易，性能穩定。

技術背景

陽離子熒光羰花青染色劑JC-1（5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine iodide）是一種對膜電位高度敏感的染色劑。它特異性地進入線粒體，分布和結合在線粒體基質上。線粒體膜電位的高低變化決定了JC-1的分布濃度。電位高，JC-1形成聚集體，而濃度高，熒光顯色為紅色或桔紅色；反之，則為綠色。熒光減弱表明線粒體內膜功能受到損害。

產品內容

染色液（Reagent A）     40微升

稀釋液（Reagent B）      5毫升

清理液（Reagent C）      20毫升

產品說明書       1份

保存方式

保存清理液（Reagent C）在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里；染色液（Reagent A）避免光照；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于工作液配制的容器

培養箱：用于染色孵育

（共聚焦）熒光顯微鏡：用于冰凍切片組織細胞線粒體熒光定性分析

實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的染色液（Reagent A）置入冰槽里融化，稀釋液（Reagent B）放進37℃恒溫水槽里預熱。然后移出10微升染色液（Reagent A）到新的1.5毫升離心管，加入890微升稀釋液（Reagent B），混勻后，在冰槽里靜置，并標記為染色工作液，放在暗室里。然后進行下列操作。

• 準備5片待測的厚為10微米的未經固著處理的冰凍切片
• 置于室溫下，小心加上500微升預冷的清理液（ Reagent C），鋪滿整個切片表面
• 小心移去切片上的清理液（Reagent C）
• 小心加上200微升室溫預熱的染色工作液，鋪滿整個切片表面
• 在37℃濕潤培養箱里，孵育20分鐘（注意：避免液體蒸發）
• 小心移去切片上的染色工作液，避免光照
• 小心加上500微升清理液（Reagent C），鋪滿整個切片表面
• 小心移去切片上的清理液（Reagent C）
• 放上蓋玻片或封片（注意：檢測前置于冰槽里）
• 即刻在倒置熒光顯微鏡下進行觀察（單濾波或雙濾波）：

觀察紅色熒光：濾波器激發波長490nm，散發波長590nm或羅丹明（rhodamine）濾波器激發波長540nm，

              散發波長570nm或德州紅（Texas Red）濾波器激發波長590nm，散發波長610nm--可見

              亮紅色熒光；如果強度顯著減弱，表明線粒體膜電位受到破壞

觀察綠色熒光：濾波器激發波長490nm，散發波長530nm或熒光素（Fluorescein）濾波器激發波長490nm，

              散發波長520nm--如果綠色熒光強度顯著增強，表明線粒體膜電位受到破壞，未結合JC

              -1染料在細胞漿里

注意事項

• 本產品為20次操作
• 操作時，須戴手套
• 染色工作液避免光照
• 用戶根據實際需求，按比例配制試劑用量
• 根據不同組織類型，調整染色工作液的使用劑量（1：100至1：1000容量比），避免過度染色
• 建議切片組織染色完成后，即刻進行熒光檢測分析
• 孵育時，避免光照
• 雙濾波或雙重測定：健康細胞和線粒體呈現紅色；死亡或凋亡細胞及損傷線粒體呈現綠色
• 本公司提供系列線粒體試劑產品