組織硫代巴比妥酸反應物（TBARS）比色法定量檢測試劑盒

產品說明書（中文版）

主要用途

組織硫代巴比妥酸反應物（TBARS）比色法定量檢測試劑是一種旨在通過TBARS（硫代巴比妥酸反應物）技術，檢測與之反應的丙二醛，其產物丙二醛雙硫代巴比妥酸加合物，在分光光度儀下，檢測其吸光峰值的變化，即采用比色法測定組織樣品中硫代巴比妥酸反應物含量的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種動物組織（人體、動物、昆蟲等）中硫代巴比妥酸反應物的含量檢測。廣泛用于組織氧化應急研究，特別是脂質過氧化的分析。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定，重復性好。

技術背景

脂質過氧化反應（lipid peroxidation；LPO）是動物和植物細胞損傷的一種機制，也是評價細胞和組織氧化應急的標志。含有兩個或以上雙鍵（double bond）的多聚不飽和脂肪酸（Polyunsaturated Fatty Acid）對自由基以及其它活性氧化族高度敏感，導致產生脂質過氧自由基LOO^＋（lipid peroxyl radical），使脂類氧化（lipid oxidation）。脂質過氧化自由基LOO^＋同時通過攻擊分子內雙鍵，經環化、裂解形成環狀內過氧化物（cyclic endoperoxide），例如丙二醛（malondialdehyde；MDA）和4-羥基壬烯酸（4-hydroxynonenal；HNE）等氫過氧化物（hydroperoxide）和醛（aldehyde），為自然產生的脂質過氧化產物，屬于硫代巴比妥酸反應物（TBARS）混合物。硫代巴比妥酸反應物含量增加，表明氧化應急增強。作為脂質過氧化性低分子量終端產物之一的丙二醛，廣泛用于脂質過氧化反應的指標，即硫代巴比妥酸反應物（thiobarbituric acid reactive substance；TBARS）表述為丙二醛等類物（MDA equivalentlent），以評價脂質氧化或氧化應急程度。在丁羥甲苯（Butylated Hydroxytoluene；BHT）和EDTA的參與幫助減少干擾性脂類氧化的情況下，丙二醛與硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid；TBA）進行反應，產生丙二醛雙硫代巴比妥酸加合物（MDA-TBA2），通過分光光度儀（532nm波長）來定量分析硫代巴比妥酸反應物的含量，其反應方式為：

產品內容

保存方式

保存在4℃冰箱里，抗干擾液（Reagent C）和反應液（Reagent E）避免光照，并密封；萃取液（Reagent D）具有腐蝕性，注意操作安全；有效保證6月

用戶自備

15毫升錐形離心管：用于制備樣品的容器

1.5毫升離心管：用于制備樣品和樣品反應的容器

超聲儀：用于裂解組織的儀器

（微型）臺式離心機：用于樣品收集、澄清

恒溫水槽：用于反應孵育

酶標板：用于比色的容器

酶標儀：用于樣品比色分析

實驗步驟

實驗開始前，將試劑盒中的反應液（Reagent E） 置入冰槽里。移取xx微升稀釋液（Reagent G）到 反應液（Reagent E）管里，渦旋混勻，標記為反應工作液（10次操作量）。同時設定好酶標儀（溫度為25℃）：波長532nm。然后進行下列操作。

一、樣品準備 

• 手術取出動物組織，并秤重以確定組織重量 
• （選擇步驟）放進預冷的50毫升錐形離心管（500毫克組織）
• （選擇步驟）加入xx毫升緩沖液（Reagent A） 
• （選擇步驟）小心抽去緩沖液（Reagent A）
• 移入到一個液氮凍存管
• 即刻放進液氮罐過夜
• 次日從液氮罐里取出，即刻（zui快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）
• 放進一個15毫升錐形離心管
• 加入置于冰槽里的xx微升裂解液（Reagent B） 
• 強力渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 在冰槽里，置于200瓦超聲儀下，功率50％，猝擊5秒
• 轉移到預冷的1.5毫升離心管
• 強力渦旋震蕩15秒
• 放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為3000g（或6000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管
• （選擇步驟）移取10微升進行蛋白定量測定，并調整蛋白濃度為20至50毫克/毫升
• 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作

二、比色測定

• 準備10個1.5毫升離心管，并做好相應標記：背景對照和樣品
• 分別移取xx微升緩沖液（Reagent A） 
• 分別加入xx微升抗干擾液（Reagent C）
• 分別加入xx微升補充液（Reagent F）或待測樣品（注意：總量為1至2毫克總蛋白）
• 用槍頭混勻
• 分別加入xx微升萃取液（Reagent D）
• 用槍頭混勻
• 分別加入xx微升反應工作液
• 蓋上蓋子，上下傾倒數次，混勻
• 放進60℃恒溫水槽，孵育60分鐘
• 放進冰槽里冷卻2分鐘
• 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為10000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 分別移取250微升上清液到96孔酶標板的相應孔里（注意：上清須澄清）
• 放進酶標儀檢測 
• 樣品實際讀數：（樣品讀數－背景對照讀數） 

三、計算樣品總濃度

注意事項

• 本產品為20次操作
• 操作時，須戴手套
• 用戶可以采用組織勻漿（30秒）處理代替超聲處理
• 萃取液（Reagent D）具有腐蝕性，注意操作安全
• 反應液（Reagent E）為固體，避免在室溫下放置；配制后，有效期1周
• 抗干擾液（Reagent C）和反應液（Reagent E）避免光照，并密封
• 本產品檢測敏感度可達0.05微摩爾丙二醛等類物
• 50微摩爾的過氧化氫和0.25摩爾蔗糖會干擾檢測（使丙二醛減少13％）
• 如果樣品含有過高的蛋白成分，建議進行樣品去蛋白處理
• 可以使用煮沸10分鐘替代60℃孵育反應 60分鐘
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度
• 正常樣品的硫代巴比妥酸反應物濃度相當低，約在皮摩爾水平，即10至100皮摩爾/毫克蛋白
• 本公司提供系列丙二醛檢測試劑產品

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定檢測敏感