提高RT-PCR的靈敏度與產物長度

時間：2012-2-17閱讀：1589

材料和方法

1. Eppendorf cMaster RTplusPCR系統

2. Eppendorf Perfect RNA Eukaryotic試劑盒

3. 所有的PCR反應均在Eppendorf Mastercycler-gradient梯度PCR儀上進行。

實驗1：一步法靈敏度檢測RT－PCR

擴增目標：500 bp 的人α微管蛋白mRNA 片段。

模板RNA：從人HELA細胞中純化的總RNA。反應中應用的模板濃度從1μg遞減至10pg。

方案：Eppendorf cMaster RTplusPCR系統，標準一步法RT－PCR方案。1:10 稀釋RTplusPCR 緩沖液，鎂離子終濃度2.5 mM，反應總體積50μl

循環參數：

循環	步驟	溫度	時間	描述
1x 1	1	50°C	30分鐘	逆轉錄
1x 2	2	94°C	3分鐘	初始變性
40x {	3	94°C	15秒	模版變性
40x {	4	68°C	45秒	引物退火/延伸

cMaster RTplusPCR 系統顯示出一種依賴于模板RNA 量的寬廣的產物產量動力學范圍。能從低至10 pg 的HELA 總RNA中檢測到α微管蛋白mRNA。

實驗2：一步法擴增長片段RT－PCR

擴增目標：5.3 kb 的人結節性腦硬化因子(hTSF)mRNA 片段。

模板RNA：從人HELA 細胞中純化的總RNA。反應中應用的模板濃度為100 ng 和10 ng。

方案：Eppendorf cMaster RTplusPCR 試劑盒，針對長模板的特殊RT－PCR 方案。

設置一步法RT－PCR 反應。

成分	50μl RT－PCR反應體積	反應成分的終濃度
不含RNA 酶的水	2.5μl
dNTP 混合物每種dNTP 濃度均為10 mM	2.5μl	500μM
hTSF正向引物	1.0μl	200 nM
hTSF反向引物	1.0μl	200 nM
總HELA RNA	3.0μl	每個反應中中含10ng－100ng
MasterMix 1	10.0μl
不含RNA 酶的水	34.0μl
含鎂離子的RTplusPCR 反應緩沖液	5.0μl	1×；2.5 mM 鎂離子
cMaster RT 酶	0.5μl	0.15U /μl
cMaster PCR 酶混合物	0.5μl	0.05U /μl
MasterMix 2	40.0μl

循環程序參數

循環	步驟	溫度	時間	描述
1x	1	65°C	5分鐘	初始RNA變性
1x	2	42°C	60分鐘	逆轉錄
1x	3	93°C	3分鐘	初始變性
35x {	4	94°C	15秒	模版變性
	5	59°C	30秒	引物退火
	6	68°C	5.5分鐘	引物退火

應用一步法RT－PCR 方法，可以從100 ng 和10 ng 總RNA 中檢測到5.3 kb 的hTSF PCR 產物。這個PCR 反應非常困難，大多數RT－PCR 試劑盒生產廠家從未發布過應用一步法方案，有效擴增類似長度模板的結果。相反，Eppendorf 試劑盒能穩定可靠地從10 ng HELA 細胞RNA 中擴增該產物。

實驗3：兩步法RT－PCR

兩步法RT－PCR 的擴增目標：

500 bp 的(鼠和人)α微管蛋白mRNA 片段

1.3kb 的(鼠和人)腫瘤壞死因子受體(TNFR1)mRNA 片段

5.3 kb 的人結節性腦硬化因子(hTSF)mRNA 片段

12.3 kb 的鼠動力蛋白mRNA 片段

方案：Eppendorf cMaster RTplusPCR 試劑盒，采用產品說明書中的針對普通長度模板和較長模板的兩步法RT－PCR 程序。所有的逆轉錄反應均采用0.5μg 的Oligo(dT)20 引物為引物。

設置*步RT 反應

成分	以Oligo(dT)20 為引物進行逆轉錄	反應成分的終濃度
不含RNA 酶的水	加至MasterMix 1 總體積為10μl
dNTP 混合物每種dNTP 濃度均為10 mM	1.0μl	1mM
Oligo(dT)20 引物(0.5μg /μl)	1.0μl	25ng/μl
模版RNA
HELA (350ng/μl)	3.0μl	} 1μg總RNA
A細胞(1 μg/μl)	1.0μl
L細胞(220ng/μl)	4.5μl
McCoy細胞(135ng/μl)	7.0μl
MasterMix 1	10.0μl
不含RNA 酶的水	5.0μl
含鎂離子的RTplusPCR 反應緩沖液	4.0μl	2×；5 mM 鎂離子
RTplusPCR 反應緩沖液
cMaster RT 酶	1μl	0.75U /μl
MasterMix 2	10.0μl

設置第二步PCR 反應

成分	普通PCR(微管蛋白TNFR1)	長片段(動力蛋白，hTSF)	反應成分終濃度
不含RNA 酶的水	7.0μl	6.0μl
正向引物	1.0μl	1.0μl	0.2μM
反向引物	1.0μl	1.0μl	0.2μM
*步逆轉錄反應產物	1.0μl	2.0μl	N / A
MasterMix 3	10.0μl	10.0μl
33.6μl
不含RNA 酶的水	33.6μl	32.0μl
含25 mM 鎂離子的RTplusPCR 反應緩沖液	5.0μl	－	1×；2.5 mM 鎂離子
含25 mM 鎂離子的 10×Tuning 反應緩沖液	－	5.0μl	1×；2.5 mM 鎂離子
dNTP 混合物/ 每種dNTP 濃度均為10 mM	1.0μl	2.5μl	200μM(500μM)
cMaster PCR 酶混合物	0.4μl(2U)	0.5μl(2.5U)	0.04－0.05 U /μl
MasterMix 4	40.0μl	40.0μl

RT反應條件

步驟	溫度	時間	描述
1	65°C	5分鐘	初始模版變性
2	0°C	5分鐘	冷卻變性模版
3	42°C	60分鐘	*鏈cDNA合成
4	-20°C	直到PCR	引物退火/延伸

注：動力蛋白的逆轉錄孵育時間延長至90 分鐘。

循環	步驟	溫度	時間	描述
1x	1	94°C	3分鐘	初始變性
35x {	2	94°C	15秒	模版變性
35x {	3	68°C	40s/60s	引物退火/延伸

* -- 微管蛋白

** -- TNFR1

hTSF 和動力蛋白的三步循環方案

循環	步驟	溫度	時間	描述
1x	1	93°C	3分鐘	初始模版變性
35x{	2	93°C	15秒	模版變性
	3	56°C	30秒	引物退火
	4	68°C	12分鐘	引物延伸

不同大小目的片段所采用的延伸時間和退火溫度

目的片段	微管蛋白	TNFR1	hTSF	動力蛋白
延伸時間(PCR)	40秒	1分鐘	5.5 分鐘	12 分鐘
退火溫度	68℃	68℃	59℃	56℃
退火時間	-	-	30 秒	30 秒
每循環增加時間	-	-	-	20 秒

結果

對5 種不同表達水平的基因進行RT－PCR。為了得到zui高的靈敏度，RT 和PCR 反應分開進行。如圖3 所示，對于α微管蛋白和TNFR1，我們可以應用兩步法RT－PCR 方法并將退火和延伸步驟合并為進行一次68℃ 孵育。如圖3 所示，無論片段長度大小和拷貝數高低，所有反應都可以順利進行。即使對于動力蛋白這種特別長(達12.3 kb)的稀有轉錄本，用cMaster RTplusPCR 系統也能夠進行有效擴增，而且結果具有的重復性，表明即使對于困難的RT－PCR 反應， Eppendorf 試劑盒也能獲得可靠結果。

討論

cMaster RT 系統是為了給所有的RT 和RT－PCR 應用提供zui大的靈活性而設計的。該試劑盒結合了重組的同二聚體病毒逆轉錄酶和*的RTplusPCR 反應緩沖液系統，可以在較寬的溫度范圍(37℃－60℃)和0.2kb-12.5kb產物大小范圍內進行有效的cDNA 合成。cMaster RTplusPCR 酶混合物兼具熱穩定性DNA 聚合酶活性，校正功能輔助的保真性和高延伸效率。應用于一步法中，可以靈敏地檢測到極少量的總RNA 并擴增出長達5.3 kb的cDNA。兩步法方案可以從RT 反應中擴增多個目的cDNA，PCR產物的片段長度可增加至12.3 kb。其他的擴展應用：系統的逆轉錄部分即cMaster RT 可以與任何PCR系統合用或者為其他下游應用如雜交實驗合成cDNA 探針。

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