小鼠胱天蛋白酶9（Caspase-9）ELISA試劑盒說明書

小鼠胱天蛋白酶9（Caspase-9）ELISA試劑盒僅供研究使用

預(yù)期應(yīng)用:ELISA法定量測定小鼠血漿、細胞培養(yǎng)物上清或其它相關(guān)液體中Caspase-9含量。

實驗原理:本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心酶標(biāo)免疫分析法測定標(biāo)本中Caspase-9水平。用純化的抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入Caspase-9抗原、化的抗小鼠Caspase-9抗體、HRP標(biāo)記的親和素，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的Caspase-9呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。 

特異性:本試劑盒可同時檢測重組或天然的小鼠Caspase-9，且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。

組成:

1. 酶聯(lián)板：一塊（96孔） 

2. 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，其濃度為1000 pg/mL，做系列倍比稀釋后，分別稀釋成1000 pg/mL，500 pg/mL ，250 pg/mL，125 pg/mL，62.5 pg/mL，31.2 pg/mL，15.6 pg/mL，其原液直接作為zui高標(biāo)準(zhǔn)濃度，樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 pg/mL，臨用前15分鐘內(nèi)配制。

3. 樣品稀釋液：1×20ml/瓶。

4. 檢測稀釋液A：1×10ml/瓶。

5. 檢測稀釋液B：1×10ml/瓶。

6. 檢測溶液A：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液A1：100稀釋。

7. 檢測溶液B：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液B1：100稀釋。

8. 底物溶液：1×10ml/瓶。 

9. 濃洗滌液：1×30ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。 

10. 終止液：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。

標(biāo)本的采集及保存 :

1.血漿：用32％1：9（如：0.5mL 32％+4.5mL全血）抗凝，血液和抗凝劑須充分混均，使終濃度為3.2%。血漿標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或?qū)?biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

2.細胞培養(yǎng)物上清：請離心后收集上清，并將標(biāo)本保存于-20℃，且應(yīng)避免反復(fù)凍融。

注：標(biāo)本溶血會影響zui后檢測結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進行此項檢測。

操作步驟:

各試劑在使用前平衡至室溫。

1. 加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔。除空白孔外，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)溶液或待測樣品100ul，輕輕混勻，37℃，120分鐘。

2. 棄去液體，甩干，不用洗滌。

3. 每孔加檢測溶液A工作液 100ul，37℃,60分鐘。洗板3次，350ul/每孔，甩干。 

4. 每孔加檢測溶液B工作液 100ul，37℃，60分鐘，洗板5次，甩干。

5. 依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光顯色30分鐘。

6. 依序每孔加終止溶液50ul，終止反應(yīng)。用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。 

注：

1.每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2NH2SO4。測量時先用此孔調(diào)OD值至零。 

2.為防止樣品蒸發(fā)，試驗時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)。

洗板方法:

1.自動洗板：如果有自動洗板機，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中。

2.手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘，根據(jù)需要，重復(fù)此過程數(shù)次。

計算: 以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)（對數(shù)坐標(biāo)），OD值為縱坐標(biāo)（普通坐標(biāo)），在半對數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。 

注意事項:

1． 洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。

2． 一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，使用排槍加樣。

3． 請每次測定的同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線，做復(fù)孔。

4． 如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù)。

5．在配制標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液工作液時，請以相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。

6．底物請避光保存。

說明 

1.在儲存及孵育過程中避免將試劑暴露在強光中。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和污染，試劑避免受到微生物的污染，因為蛋白水解酶的干擾將導(dǎo)致出現(xiàn)錯誤的結(jié)果。

2. 小心吸取試劑并嚴(yán)格遵守給定的孵育時間和溫度。請注意在吸取標(biāo)本 / 標(biāo)準(zhǔn)品，酶結(jié)合物或底物時，*個孔與zui后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大，將會導(dǎo)致不同的 “預(yù)孵育”時間，從而明顯地影響到測量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性。而且，洗滌不充分將影響試驗結(jié)果。

3. 試劑盒保存：部分試劑保存于-20℃，部分試劑保存于2-8℃，具體以標(biāo)簽上的標(biāo)示為準(zhǔn)。

4. 濃洗滌液會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。 

5. 剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì)，此為正常現(xiàn)象，不會對實驗結(jié)果造成任何影響。 

6. 中、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準(zhǔn)。

7. 所有的樣品都應(yīng)管理好，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置。

8. 有效期：6個月