凡需進行病理研究的標本均需進行固定。將組織置于某些化學試劑中，使細胞內的物質免疫組織化學實驗技術及應用盡量接近于其生活狀態時的形態結構和位置稱為固定。而用于免疫組化研究標本的固定不僅是使細胞內的蛋白質凝固，終止或減少外源性和內源性細胞內分解酶的反應，防止組織細胞自溶，更重要的是保存組織或細胞內的抗原性，使抗原不失活，不發生彌散。

不同的抗原，其抗原穩定性不同，依抗原耐受固定液的程度可分為：①不穩定性抗原，如T淋巴細胞表面抗原屬此類抗原，一般以冰凍切片進行免疫組化染色；②半穩定性抗原，如B淋巴細胞的胞漿免疫球蛋白等；③較穩定抗原，例如HBsAg、HBcAg、AFP、CEA、S—100、Keratin和部分多肽類激素等，其抗原性受固定劑種類、固定時間、溫度等影響不大。

固定劑的種類很多，性能不一，因此固定不同的組織應選擇合適的固定劑，特別是標記半穩定抗原時，更要選擇合適的固定劑和固定條件。

一、固定液的種類

較好的固定液應具有強滲透力，能迅速滲入至組織內部；其次不會使組織發生過度收縮變形，并能使組織內易觀察的成分得以凝固為不溶性物質；還要使組織達到一定硬度，有較好的折光率。固定液分為簡單固定液和混合固定液。

二、固定的方法

1．浸泡法

這是zui常用的固定法，將取好的組織直接浸泡在固定液中，固定的時間一般在2～24h它適用于動物標本、尸檢標本及臨床活檢標本等。

2．蒸氣法

比較小而薄的標本可用鋨酸或甲醛蒸氣固定。主要用于血液、細胞涂片以及某些薄膜組織的固定。具體方法：在一有蓋培養皿內滴人1％一2％鋨酸水溶液3滴，將涂片放人其中，固定30s至lmin左右，立即水洗后進行染色。

3。注射、灌注固定法

主要適用于動物實驗標本的固定。將固定液注入血管，以達到充分的固定。經血管分支到達整個組織或全身

（1）局部灌注固定 固定肺組織可將固定液從氣管或支氣管注入，注入速度不要太快，用力均勻，注入量適當，以免脹破肺泡。固定眼球組織可從眼后房注人固定液。固定肝、腎組織則可從肝、腎動脈注入固定液，同時切斷其靜脈使得血液排出。腦組織的固定，必須先麻醉動物，分離頸動脈，注射器的針尖向著頭部的方向注入固定液。

（2）全身灌注固定 較大的動物往往采取輸液方法，將固定液從一側頸總動脈或股動脈輸入，將另一側相應的靜脈切開放血。固定液的輸入量因動物而異，兔、貓約500～1000ml，猴、狗約1000—2000ml。

4．微波固定法

近幾年來微波固定法一直可見報道。經微波固定的組織具有收縮較小、核膜清晰、染色質均勻、分辨清晰等特點，但必須嚴格控制微波固定的時間和溫度。

三、固定的注意事項

1．固定液的量

固定組織時，必須有足夠的固定液，一般為組織塊體積的10～15倍。固定用的容器必須足夠大，組織材料不要太多，避免組織中的水分滲出而影響固定液的濃度。

2.固定的組織必須新鮮

組織取材后應立即固定，否則，組織易收縮變形，并發生自溶現象。

3.組織塊的體積

組織塊的體積宜小而薄，一般用于免疫組化的組織大小宜為1．OcmXl．OcmX 0．2cm。組織太大，內部得不到充分固定，導致組織結構破壞，給切片帶來一定的困難，還增加非特異染色，同時浪費試劑。

4．組織固定后的沖洗

組織固定后，因固定液滲到組織中，所以必須*沖洗，除去固定液，否則會影響下一步的脫水。特別對于長時間固定的標本應用流水沖洗，盡可能減少色素沉著。對于混合固定液固定的組織，更要及時沖洗，否則將影響免疫組化切片的質量。

四、影響固定的因素

1．溫度

一般固定液固定效果隨溫度升高而加強，溫度一般在-70～37℃之間，·以室溫22℃常用。某些酶的固定要求在37℃以下進行，而某些病毒的固定則要在低溫下進行，如用丙酮在-20一-40℃之間固定30min*。對于臨床活檢標本，固定時間要求短，實踐發現用中性甲醛在40℃左右固定2～3h即可。

2．濃度

10％中性甲醛、4％多聚甲醛zui合適，乙醇zui常用濃度為95延。在37℃或室溫固定，適合于許多蛋白質、抗原，并能保持其與抗體的反應能力。70％的乙醇固定能力zui強。

3．固定時間

固定時間要視組織塊的大小及固定液的種類、濃度、溫度而定。組織塊越大，固定時間越長；反之，組織塊越小，固定時間越短。固定液的穿透力與濃度成正比，固定的時間與溫度成反比。總之，固定的時間應根據條件而定。

沒有任何一種固定液適合于所有組織的固定，應根據條件選擇合適的固定液，可以用多種固定液固定作對比，找到比較切合本單位實際的固定液。