單克隆抗體制備流程

單克隆抗體制備流程
（一）融合劑
細胞融合的方法有物理法，如電融合、激光融合，化學融合法和生物融合法，如仙臺病毒，此處例舉化學融合法中的一種即聚乙二醇融合法。聚乙二醇（PEG），在分子量為200～700時，呈無色、無臭的粘稠狀液體，分子量大于1000時，呈乳白色蠟狀固體，能溶于水、乙醇及其他許多有機溶劑，對熱穩定，與許多化學藥品不起作用。用作細胞融合劑的聚乙二醇一般選用分子量為4000者，常用濃度為50％，pH8.0～pH8.2（用10％NaHCO3調整），分子量小的PEG，融合效應差，又有毒性，分子量過大，則粘性太大，不易操作。50％濃度，pH偏堿時融合效應zui高。也有采用30%～50％濃度的PEG加上10％二甲亞砜。不同批號的PEG，即使分子量相同，但融合率卻有明顯差異，選用時必須注意。每批都必須進行細胞毒性試驗后方可應用。要買高純度的，一般選供氣相色譜用的PEG。

（二）融合過程
融合的方法很多，常用的有轉動法和離心法。融合時脾細胞和骨髓瘤細胞的比例為1:1至10:1不等。3:1或5:1zui為常用。
1．試劑與材料
（1）供融合用的脾細胞及骨髓瘤細胞。
（2）1640培養液100ml。
（3）*1640液100ml。
（4）2.5％FCS－1640液50ml。
（5）HAT培養液100ml。
（6）50％PEG：取分子量4000，高純度的（日本進口或Serva）PEG10g放入25ml瓶中高壓滅菌，使用前用預熱于40℃的1640液10ml等量（W/V）混合，以酚紅檢查pH，一般不必調pH。如pH有改變，可用HCl或NaHCO3調整。
（7）10ml和50ml的滅菌沉淀管或瓶。
（8）40孔塑料培養盤。

單克隆抗體制備
2．操作方法
⑴準備好脾細胞。
⑵在50ml沉淀管中混合108脾細胞和107小鼠骨髓瘤細胞，并加入50ml2.5％FCS－1640液。
⑶室溫400g離心3min，使細胞沉淀。
⑷移去上清液。
⑸輕敲管底部，使沉淀流動，把沉淀管放于40℃水浴中，使其達融合溫度。
⑹加預熱至40℃的50％PEG0.8ml，用1ml吸管緩慢滴加，邊加邊搖沉淀管，肉眼觀察可見有顆粒出現，滴加過程要求持續2min。
⑺加1ml1640液，邊加邊搖動，持續1min。
⑻重復⑺一次。
⑼加1ml1640液，邊加邊搖動，持續0.5min。
⑽重復⑼一次。
⑾加1640液15ml。
⑿室溫，400g離心1min，使細胞沉淀。
⒀去上清，輕敲管底部，加25ml含有HAT的*1640液。
⒁往已于前一日種有飼養細胞的40孔塑料培養盤中滴加融合的細胞液，每孔1滴（約0.05ml）。
⒂輕搖后，放入5％CO2飽和濕度的37℃溫箱中培育。
⒃第3、6、9、10日換入含HAT的*1640培養液。注意輕輕吸取上清液，勿將固定于孔底的細胞吸出，根據需要加入適量的飼養細胞。
⒄于第12、15日加入含有HAT的*1640培養液。在每次換液前用倒置顯微鏡觀察，大約在10天左右就可觀察到雜交瘤細胞生長出來。大多數雜交瘤細胞在10~20天內出現，但也有在1個月左右才能出現的。雜交瘤細胞出現后，吸取上清液，檢查抗體。
⒅對繼續生長的雜交瘤細胞進行增殖傳代。在傳代過程中，依情況取消HAT液和*1640液而代之以10%FCS－1640液。同時保存于液氮和進行克隆化，在這期間每代都要檢查抗體，以防止產生抗體細胞的變異和丟失。

（三）細胞融合的關鍵
1．技術上的誤差常常導致融合的失敗。例如，供者淋巴細胞沒有查到免疫應答。這必然要失敗的。
２．融合試驗zui大的失敗原因是污染，融合成功的關鍵是提供一個干凈的環境，以及適宜的無菌操作技術。