T淋巴細(xì)胞是一個復(fù)雜的不均一的群體，根據(jù)其發(fā)育的不同階段、表面標(biāo)志物及功能的不同可分為若干亞群，他們在特異性免疫應(yīng)答中起著關(guān)鍵性作用。T細(xì)胞不僅介導(dǎo)細(xì)胞免疫而且對B細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫也起著重要的輔助和調(diào)節(jié)作用。T細(xì)胞通過不同的膜表面分子及其分泌的各種細(xì)胞因子參與和調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。

(一)細(xì)胞毒功能的測定

    T細(xì)胞克隆的殺傷能力多采用51Cr釋放試驗來衡量。根據(jù)克隆的抗原特異性和不同實驗?zāi)康模蛇x擇攜帶特異性抗原的細(xì)胞或無關(guān)細(xì)胞作為靶細(xì)胞，后者采用NK敏感的K562細(xì)胞或NK不敏感的H7402細(xì)胞。

1．特異性靶細(xì)胞的制備此類抗原多為胞內(nèi)致病微生物如病毒、原蟲及胞內(nèi)感染菌等．將特異性抗原和無關(guān)抗原分別與自體或異體抗原易感細(xì)胞共同孵育，時間在數(shù)小時至12h。

2．1×106／0．4ml靶細(xì)胞加入100μci51Cr，5％C02 37℃培養(yǎng)2h。

3．靶細(xì)胞洗3遍，按不同效靶比與克隆細(xì)胞混合后37℃培養(yǎng)4h(靶細(xì)胞為5×103／孔，另設(shè)靶細(xì)胞對照孔。

4．吸取上清液測定cpm值，根據(jù)相應(yīng)公式計算出細(xì)胞毒活性。

(二)輔助功能的測定

    主要觀察對自體B細(xì)胞的增殖和特異性抗體產(chǎn)生的輔助能力。常將放射后去增殖活性的克隆T細(xì)胞與自體B細(xì)胞、特異性抗原、飼養(yǎng)細(xì)胞共同培養(yǎng)后，以3 H-TdR摻人試驗觀察B細(xì)胞的增殖情況，取培養(yǎng)上清液測定特異性抗體的產(chǎn)生量。

1.輔助B細(xì)胞增殖實驗

(1)用E花結(jié)沉降分離法分離人T和B細(xì)胞。

(2)將40Gy照射的抗原特異性T克隆細(xì)胞或無關(guān)T克隆細(xì)胞1×104／孔；自體B細(xì)胞5×104／孔及40Gy照射的自體PBMC 5×104／孔在適量目的抗原存在時共同培養(yǎng)，每孔*細(xì)胞培養(yǎng)液總量為200μl。

(3)5％CO237℃培養(yǎng)7d，培養(yǎng)終止前24h加入1μl3H-TdR／孔。

(4)測定樣本cpm值，比較抗原特異性T克隆細(xì)胞和無關(guān)T克隆細(xì)胞對自體B細(xì)胞照射的影響程度。

2．輔助特異性抗體產(chǎn)生實驗

(1)用E花結(jié)沉降分離法分離人T和B細(xì)胞。

(2)將40Gy照射的抗原特異性T克隆細(xì)胞或無關(guān)T克隆細(xì)胞1×104／孔；白體B細(xì)胞5×104／孔及40Gy照射的自體PBMC 5×104／孔在適量目的抗原存在時共同培養(yǎng)，每孔*細(xì)胞培養(yǎng)液總量為200μl。

(3)5％CO2 37℃培養(yǎng)3d，將細(xì)胞洗滌3次后以*細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮后繼續(xù)培養(yǎng)7d。

(4)收集上清液，測定上清液中特異性抗體的含量。比較抗原特異性T克隆細(xì)胞和無關(guān)T克隆細(xì)胞對自體B細(xì)胞特異性抗體產(chǎn)生的影響程度。

(三)細(xì)胞因子分泌功能的測定

    可利用不同的誘導(dǎo)劑如相應(yīng)抗原、抗CD3抗體、PHA等刺激克隆細(xì)胞，收集上清液后測定產(chǎn)生的各種細(xì)胞因子。

1．末次飼養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)PHA刺激后10～15d為理想的測定時間，此時飼養(yǎng)細(xì)胞基本死亡，而克隆細(xì)胞也不再自發(fā)產(chǎn)生細(xì)胞因子。

2．取克隆細(xì)胞，充分洗滌后以5×104／孔加入96孔U型培養(yǎng)板上，并添加40Gy照射的自體PBMC l×lO5／孔作為抗原遞呈細(xì)胞，另設(shè)不加誘導(dǎo)劑孔為對照。

3．5％CO2 37℃培養(yǎng)，分別于24h、48h、72h等不同時間收集上清液，無菌一20℃保存。

4．用生物活性法或ELISA法測定各因子濃度。