(一)基本原理

    根據(jù)HLA核苷酸堿基序列的多態(tài)性和已知的DNA序列，設(shè)計(jì)一系列等位基因型別特異性順序引物。引物的3'-端堿基根據(jù)多態(tài)性序列與其嚴(yán)格互補(bǔ)。因此，每一型別都具有特定的引物對(duì)相對(duì)應(yīng)。通過(guò)特定的PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增各等位基因的型別特異性DNA片段，產(chǎn)生相對(duì)應(yīng)的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物條帶。如果是純合子，產(chǎn)生一條與特異性引物相對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增帶；如果是雜合子則產(chǎn)生兩條與特異性引物對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增帶。其特異性可到分辨出一個(gè)堿基的差異。擴(kuò)增產(chǎn)物僅需借助常規(guī)的瓊脂糖凝膠電泳，即可根據(jù)是否存在特異性產(chǎn)物的電泳條帶直接進(jìn)行HLA基因分型。抗原

(二)方法

1．PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)這是首先建立的對(duì)多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)的DNA分析技術(shù)。個(gè)體間抗原特異性來(lái)自氨基酸順序的差別，后者由編碼基因的堿基順序不同所決定。這種堿基順序的差別造成限制性內(nèi)切酶識(shí)別位置及酶切位點(diǎn)數(shù)目的不同，從而產(chǎn)生數(shù)量和長(zhǎng)度不一的DNA酶切片段。用特異性探針對(duì)整個(gè)基因組DNA酶切片段進(jìn)行雜交，即可分析限制性長(zhǎng)度片段多態(tài)性。該法不需探針，簡(jiǎn)單快速，可識(shí)別單個(gè)堿基不同的序列及2個(gè)連鎖的位點(diǎn)。

2．PCR一序列特異性寡核苷酸探針(sequence specific oligonucleotide probes，SSOP)此法用人工合成的HLA型別特異的寡核昔酸序列作為探針，與待檢細(xì)胞經(jīng)PCR擴(kuò)增的HLA基因片段雜交，從而確定HLA型別，PCR技術(shù)可將HLA復(fù)合體上基因片段特異性地?cái)U(kuò)增5～6個(gè)數(shù)量級(jí)；而專門(mén)設(shè)計(jì)的SSOP又能探測(cè)出等位基因間1～2個(gè)核苷酸的差異，故PCR／SSOP技術(shù)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、需樣本量少等優(yōu)點(diǎn)。

3．PCR等位基因組特異性引物(．sequence specific primer，SSP) 目前常規(guī)的HLA—DNA分型技術(shù)，包括上述的PCR／RFLP、ECR／SSOP等，zui終均需用標(biāo)記的特性探針與擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雜交，再分析結(jié)果。PCR／SSP方法設(shè)計(jì)出一整套等位基因組特異性引物，借助PCR技術(shù)獲得HLA型別特異的擴(kuò)增產(chǎn)物，可通過(guò)電泳直接分析帶型決定HIJA型別，從而大大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)步驟。

    由于傳統(tǒng)方法在Ⅱ類抗原分型方面困難較大，故上述幾種基因分析型方法目前主要用于Ⅱ類基因座。此外，目前已建立的HLA-NN分型技術(shù)還包括PCR單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(PCR—single strand conformational polymorphism，PCR—SSCP)和PCR異源二聚體電泳多態(tài)即PCR指紋圖(PCR finger printing)分析。