平時在實驗室zui常聽到的一句話就是“今天某某試驗沒做好是為什么？今天某某試驗沒出結(jié)果是什么原因？今天某某試驗為什么會是這樣的呢？" 等等。然后仔細一查找原因，往往是由于操作上面的不認真，或是一些小小的細節(jié)沒有注意到。以下是集各路朋友的一些經(jīng)驗，與大家分享：
11. 在把蛋白膠做成干膠時，很多時候會因為有氣泡使膠裂掉，我的經(jīng)驗是在做膠時加上層膜前在膠上多加些水就不容易進氣泡了，還有就是高溫烘膠，我喜歡放到60度烘箱里烘，ELISA試劑盒這樣水分蒸發(fā)速度快，即使有一些小的氣泡也不會有影響，呵呵，這是經(jīng)驗之談，我從來都沒失手過，大家可以試試
12. 做大腸表達時確定蛋白是否表達一般要煮樣做誘前誘后檢測,但很多時候煮出來的很黏影響跑膠效果.我發(fā)現(xiàn)如果現(xiàn)用8M Urea重懸細菌再煮效果會有極大改善.
注:不能用Gu-HCl代替
13. 我也推薦幾個偷懶的方法
1. 做SDS-PAGE跑膠通常都是現(xiàn)配現(xiàn)用,但配膠要>1h,所以如果想第二天睡個懶覺而又不耽誤跑膠可以于前一天晚上做好濃縮膠和分離膠,待凝聚后不要拔下梳子,把含膠玻璃板從制膠槽取下,用保鮮膜包上,注意玻璃板上下兩邊緣會有氣體,所以需要加一點電泳緩沖液以避免膠內(nèi)水分蒸發(fā).然后放4度過個夜.第二天直接拔下梳子行后續(xù).國外好多公司出售腳既是如此,可以保存上星期.
2 .配置分離膠或者非變性膠時因膠凝時收縮可導(dǎo)致加樣孔變淺.可以將加剩的膠放入4度以降低凝聚速度,而將凝膠放入37度促聚,并隨時用4度加剩的膠補充下降的膠面.另外將膠橫放與水平面成~10度角也可以減少收縮的影響.
3 .推薦一個節(jié)約抗體/時間的做法:
同時跑2塊膠,同時轉(zhuǎn)膜,然后兩塊膜背靠背放入同一封口膜同時封閉,同時一抗二抗(是用轉(zhuǎn)輪,這樣效果好.如果是搖床,隔一段時間幫它們翻個身以保證兩張膜的正面都有機會與液體充分接觸.一起洗膜(可以稍微加強洗膜也可以不做.我zui多一張盤子里放4張膜而沒有影響洗膜).可分別或同時壓片.這樣就可以節(jié)約一半抗體和接近一半時間而不會影響結(jié)果.
或者另外一個就是孵育后的抗體不要扔,好的抗體可以反復(fù)做好幾張膜呢.但每次都會減弱,效果不如上面一種方法.
14.做western blotting 轉(zhuǎn)膜時，膠放在轉(zhuǎn)膜緩沖液中一段時間，待膠在含有甲醇的緩沖夜中縮小的差不多后裝 好轉(zhuǎn)膜裝置，我的經(jīng)驗是把膜印在膠上直接在膜上畫出預(yù)染maker條帶，方便的很。因為很多時候跑電泳時膠上的預(yù)染maker很清楚，等轉(zhuǎn)膜后就不是分辨的很清楚了。不過要注意畫好預(yù)染maker后就不要使膠和膜發(fā)生對位移動了，以防m(xù)aker失去參照價值。
15. 超濾zui合適用于蛋白的濃縮，更換緩沖液和除鹽，對于按照分子量進行初分離的效果不是很好，理論和現(xiàn)實是有很大差別的
16. 關(guān)于Western Blot
1）器具的清潔非常重要，開始做前，為了安全，ELISA試劑盒尤其是裝膠的厚薄玻璃板，可以先用中性洗滌劑和自來水反復(fù)沖洗，確保無洗滌殘液后用蒸餾水沖洗2－3遍，然后用去離子水沖洗一遍。zui后用95％酒精再擦一遍后晾干備用。
2）配膠現(xiàn)用現(xiàn)配，先配下層膠（分離膠），后配上層膠（濃縮膠或積層膠），而且在臨灌膠前加APS并迅速混勻，即用移液槍抽吸與注入1－2次即可。
17.跑蛋白page的時候，一開始用加樣針，太麻煩，發(fā)現(xiàn)用20ul槍+普通小白槍頭點，非常省事。另外，點樣時有可能看不清孔在哪，看遠離你的那面膠，孔有反光的。點樣也點你對面的那塊膠，省的總低頭，干咱這行的容易得頸椎呀，愛惜自己。
18. 垂直電泳時，可在電泳糟中放入*小瓶等，可自然使液面提高而不影響電泳，又很節(jié)約電泳緩沖液。
19. 我們有時要沉淀東西時，由于沉淀量很少，離心完之后不知道到底有沒沉淀下來東西，由于量很少，不好觀察，所以離心時建議按特定的方向放置離心管，這樣你就可以在離心之前確定沉淀該沉淀到管子的大致部位，這樣離心后就可直接觀察那有沒有沉淀，避免滿管子找，另外看沉淀時可以對光看，這樣就是顆粒狀的細小沉淀也能看見的。
20. 大家都知道PMSF有劇度，以前都是知道濃度和要配的體積的基礎(chǔ)上,算出要稱多少毫克的PMSF,其實也可以先稱PMSF,稱多少算多少,再調(diào)整異丙醇的體積，到達你所要的濃度。這樣就避免了你長時間和它接觸。
21. 跑好SDS-PAGE膠的一些體會。
1. 清洗好玻璃板，不要偷懶，很多時候跑完電泳撬膠時會因為玻璃板不干凈膠粘在板上把膠撬破。
2. 配膠時不要反復(fù)用槍混，稍微搖混就可以了，用槍混多次會導(dǎo)致膠凝不好影響電泳圖的分辨率。
3. AP分裝成500微升一管保存放-20度，避免AP用太久失效。
4. 倒膠時把玻璃板中的水用濾紙盡量吸干，因為微量的水存在會影響配的膠濃度。
5. 盡量不用過個夜放室溫或者四度的膠，也回影響膠 的分離效果。
6. 電泳完撬膠時根本不需要用撬膠板，在一平皿里裝好水，把有膠一面的放在水中晃動幾次膠很容易就脫落下來，一點沒有問題，方便的很。
7. 點樣時樣品別忘了離心這步，因為上樣含有固體沉淀會影響電泳圖分辨效果。
8. 盡量在冰浴狀態(tài)下跑。
22. 做2-DE做的比較多，總結(jié)了幾個小竅門：
1.一向電泳時，鹽離子容易聚在 膠槽的兩側(cè)．剪一小段ＩＰＧ膠條放在兩側(cè)，構(gòu)成鹽橋，電壓就容易上去了．避免一向電泳不好影響zui后實驗 結(jié)果．
2. SDS－PAGE時,在灌膠之前,一般大家都會用凡士林封底, 在SDS－PAGE
電 泳之前又必須把凡士林搽干凈,很是麻煩,我的經(jīng)驗是:不用凡士林,取少量未加Ap的分離膠,按比例加2倍量的Ap,然后灌入板間,等上幾分鐘,待膠凝固后就可以接著灌分離膠了.方面,效果好!
23. 蛋白質(zhì)純化時，蛋白質(zhì)降解可能與超聲破菌保持冰浴有關(guān)，之前建議加pmsf，建議在上柱子洗脫的時候也加pmsf（蛋白降解抑制劑），一定要用之前再加。
24. 做透析的時候，拿一個5ml的槍頭或者是其他類似的東西，剪短，穿過個塑料泡沫之類的面積比燒杯大東西，然后把透析帶一端扎緊，另一端開口綁緊在5ml槍頭下端，扎緊得那端也可以彎過來綁成u字型。這樣就可以用1ml的槍穿過5ml的槍頭的孔，另一只手調(diào)整透析帶，來加樣取樣，省去了總綁透析帶的麻煩，對同一個蛋白大量多次透析非常方便
25. *次發(fā)貼說一下自己的小經(jīng)驗，希望版主能給我一分，每次看到好東西因為沒分都沒法下，好羨慕有分的人啊。當然也不能不勞而獲，說一下自己的實驗技巧給大家分享。
1. 配SDS-PAGE膠時，用槍頭混勻比較麻煩，而且費時費力，效果也不好。可以剪一小段夾文件的那種曲針做轉(zhuǎn)子放到配膠的小燒杯里，在磁力攪拌器上邊攪邊加入各溶液，這樣加完也就混勻了，直接灌膠即可。
2. 上面的站友也說過，上樣用黃槍頭就行，我也一直在用，根本不用注射器，方便的很，建議大家也試試。
3.電泳后考馬斯亮藍染色一般要1h到2h，脫色也要2h左右，麻煩的很。現(xiàn)在給大家說一個簡單的方法，是我從一個師姐那里學(xué)到的。
加入染色液后，先放入微波爐里加熱5-10秒，使染色液微熱即可（千萬不要加熱太久，否則冰醋酸就揮發(fā)了）。然后放水平搖床上搖20分鐘，zui多半小時就染好了。
脫色也很簡單，不用脫色液，直接用去離子水，放微波爐里煮沸5分鐘左右，然后將水倒掉，再換上新的去離子水煮，這樣反復(fù)幾次，就可以了。效果可能比正常的脫色稍差一點點，不如那樣清楚，只要電泳時比平時多上1/5的樣品就可以了，關(guān)鍵是這樣省時省材料（用不著含甲醇和冰醋酸的脫色液）。方便快捷！
放心，反復(fù)煮膠不會把膠煮壞的。
26. 我也說說我的小經(jīng)驗。可能大家都知道，請別笑話我。
1、配膠時一定要掌握好時間，不要因為過度趕時間，而造成以后的條帶粗大，壓不成條帶，且消耗很多試劑和時間。
2、加樣時，沖洗加樣器可用雙蒸水，用電泳液會使加樣器中有很多的泡沫。或許是因為SDS的原因吧？
3、對于大分子蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)膜過個夜更好。濾紙的張數(shù)可以適當減少。
4、在跑樣時同時加入MARKER有助于正確識別所需的蛋白位置，減少NC膜的消耗。
5、一抗、二抗的濃度不要太高。
6、做ECL顯影時，根據(jù)熒光的亮度調(diào)整時間。泡完顯影液，膠片應(yīng)用水洗一下，以減少定影液變黃。
7、和有經(jīng)驗的同學(xué)交流，也是非常重要的。知識的交流有助于試驗的成功。
這是我目前的一點拙見。
27. 推薦一個省質(zhì)粒試劑盒硅膠柱與溶液的方法：
所有試劑使用手提質(zhì)粒自己配置的溶液一、溶液二、溶液三（代替試劑盒的solution1、2、3），然后一比一的與飽和*或碘化納（代替結(jié)合緩沖液）混合，就可以讓質(zhì)粒在硅膠上結(jié)合，而試劑盒的硅膠柱可以重復(fù)使用，沒有試劑盒溶液量的限制，只要是一樣的質(zhì)粒我想提幾管就提多少。
順便說一句硅膠柱也可以用自己買的硅膠粉末代替，離心后倒掉硅膠柱上面的上清就可以，用起來不象柱子方便。效果比手提的要好要快
28. 做WB時,樣品比較多, 又怕放時間長了對蛋白樣品不好,而且確定以后肯定要做某個抗體,只是一時沒有決定.那么你可以選擇先做SDS-PAGE,并轉(zhuǎn)膜. 然后把PVDF膜涼干, 放四度保存. 以后拿出來封閉后,加抗體就行了. 蛋白在膜上,且已經(jīng)分離, 比保存在BUFFER里面的蛋白肯定更可靠。29. 今天作his純化的時候，又琢磨了一個竅門，與大家分享。我得樣品比較多，幾百ml，而柱子不夠大，只有10幾ml，跑來跑去的上樣，還總得記著，太麻煩了。于是，我就刷干凈了一個燒杯，裝了我的樣品，找了一個細膠皮管，當連通器，就像魚缸換水一樣，用5ml槍在一頭一吸，液體流出來，放到純化柱里，調(diào)好燒杯的位置，兩個液面一樣平了，上了好幾個小時了，沒有問題，現(xiàn)在調(diào)低速度，過個夜上樣
30. 能導(dǎo)致PAGE膠不凝的原因主要有三個：
1、配膠中用到的主要試劑的配置。
主要就是30％的丙稀酰胺的配置。 粉末狀的丙稀酰胺和甲叉丙稀酰胺使用不應(yīng)該超過一年，因為丙稀酰胺會吸潮水解，這樣以來丙烯酸的含量就會加大，從而導(dǎo)致page膠不凝。
2、溫度。
溫度高時凝固快，但是亦不宜過高，因為溫度變化會影響交連物的孔徑大小。所以溫度在25度zui為合適。
3、氧氣。
氧氣是凝固的終止劑，所以不能讓膠中出現(xiàn)氣泡。
雖然都是些看起來聽低級的錯誤，但是不注意還是會犯。
31. 我做2維蛋白電泳，也有些心得：
1、向電泳玻璃板內(nèi)加入膠條時，先在縫隙中加入配好的溴芬蘭緩沖液，要加滿，再將膠條貼后面玻璃板壁用薄塑料片將膠條緩緩?fù)葡轮聊z上緣，這樣可以很好的避免膠條下形成空氣泡。
2、 能做出好的圖譜已經(jīng)很不容易了，如果在掃圖時撕破實在可惜，所以掃圖要小心，將凝膠轉(zhuǎn)移到掃描儀時可以用塑料隔片在下面托著，同時保持有些水，這樣就安全多了。
32. 湊個熱鬧說兩句吧
1、sds-page膠如果配好裝好倒入內(nèi)槽液以后，發(fā)現(xiàn)內(nèi)槽液稍有滲漏，可以把外槽液多加一些，加滿，加到與內(nèi)槽液相齊，這樣就可以繼續(xù)正常跑膠，不用浪費已經(jīng)加進去的內(nèi)槽液
2、至于染色脫色的問題，我們這里一直是染色：加熱半分鐘，搖20分鐘；如果染液不是新配的，就加熱半分鐘搖十分鐘，涼透了再重復(fù)一次即可
脫色也一直是用去離子水煮兩三次即可
3、不知道大家都是怎么做酶切的，我的體會是，酶切質(zhì)粒時，兩個酶分別單酶切比直接雙酶切效果要好很多。我有一次雙酶切兩次都沒連出來，后來分步單酶切，連接效率幾乎100%。
可以*個酶切完后直接把體系熱失活，（根據(jù)酶說明書上一般是65度20min）然后直接向里面補第二個酶
或者*個切完后用氯仿抽提，把蛋白提出
或者中間做一次回收，這個就要考慮回收效率和損失的問題了，但是這樣除蛋白zui*
前兩個方法我們這都是有人做過的，已經(jīng)都很好用了
33. 俺也來說說關(guān)于Bradford法蛋白濃度定量和DTNB法巰基濃度定量的一點體會：
我是做蛋白修飾巰基后，通過這兩種方法的定量來間接反應(yīng)修飾的程度。一路摸索過來，也有半年有余；zui大的體會就是不要急于求成，ELISA試劑盒直接實驗，首先檢測修飾體系是否對方法有影響，修飾基團是否會在595nm和412nm下有特定的吸收，修飾后修飾試劑本身是否會有變化，對蛋白整體結(jié)構(gòu)造成影響，其次再談具體修飾比例和程度。對于巰基濃度測定方法，有四種（Anal Biochem. 1998 Dec 1;265(1):8-14），而DTNB本身雖然靈敏度不高，但是重復(fù)性和抗干擾是*的了。
34. 考馬斯亮藍染色后的脫色，如在脫色液中加數(shù)張捏成條狀的Kimwipes紙（國外實驗室常用，相當我們的擦鏡紙，全棉纖維制造），由于染料吸附到紙纖維上，脫色加速。 待紙著色較深時，更換新紙條，不用換液。我想脫脂棉或紗布也是一樣的。但濾紙等可能不行，會溶掉。
半貼壁細胞如SP/0或雜交瘤細胞傳代時，不用吹打或刮落。先將上清吸出，適當拍打培養(yǎng)瓶（當然是塑料瓶，玻璃瓶拍碎了別找我），即可見貼壁細胞脫落，加培養(yǎng)基混懸即可。注意，過力拍打培養(yǎng)瓶會裂，特別是瓶頸。
