ELISA試劑盒在體外進行培養.使其不斷地生長、繁殖，人們借以觀察細胞的生長、繁殖、細胞分化以及細胞衰老等過程的生命現象。

細胞培養的突出優點，一是便于研究各種物理、化學等外界因素對細胞生長發育和分化等的影響;二是細胞培養便于人們對細胞內結構(如細胞骨架等)、細胞生長及發育等過程的觀察。因而細胞培養是探索和指示細胞生命活動規律的—種簡便易行的實驗技術，同時我們也不可忽略的另一個因素，那就是它脫離樂生物機體后的—些變化。

細胞培養技術目前已廣泛地被應用于生物學的各個領域。如分子生物學、細胞生物學、遺傳學、免疫學、腫痛學及病毒學等

這次的動物細胞培養是一個精細的，需要有步驟、有計劃的進行的實驗。主要步驟有：1、清洗與滅菌;2、培養基配制;3、Hanks、D-hanks液和消化液的配制、4、細胞傳代培養;5、細胞的凍存與復蘇。可分幾次小實驗進行操作。

Ⅰ清洗與滅菌

一、實驗目的

能獨立地進行用于細胞培養的各種器皿的清洗與消毒，掌握干熱滅菌法、濕熱滅菌法和濾過除菌法的操作，了解化學消毒法的使用方法。

二、實驗原理

清洗與消毒是組織培養實驗的*步，是組織培養中工作量zui大，也是zui基本的步驟。體外培養細胞所使用的各種玻璃或塑料器皿對清潔和無菌的要求程度很高。細胞養不好與清洗不*有很大關系。清洗后的玻璃器皿，不僅要求干凈透明，無油跡，而且不能殘留任何物質。如有毒的化學物質，哪怕殘留0.1個，也可能影響細胞生長。滅菌手段的選擇十分重要，對不同的物品需采用不同的滅菌方法。假如選用的方法不對，ELISA試劑盒即使達到了無菌卻使被滅菌藥品喪失了營養價值、生物學特性或其他使用價值也不行。以下在每種滅菌步驟中都介紹其使用范圍。

三、實驗材料、用品

1、材料：無臭氧型紫外燈，微孔濾膜(直徑25)：孔徑為0.22μm，微孔濾膜(直徑90)：孔徑為0.22 μm，過濾器(直徑25)。

2、藥品：70%或75%酒精，0.1%新潔爾滅，煤酚皂溶液(來蘇兒水)，0.5%過氧乙酸，乳酸，37%甲醛，*，NaOH，鹽酸，重鉻酸鉀，濃硫酸(工業)，DEPC水[體積分數0.1%的焦炭酸二乙酯(diethylpyroearbonate)]。

3、儀器：超凈臺，干燥箱，高壓鍋，過濾器，過濾泵。

四、實驗步驟

(一)實驗器具清洗

l 玻璃類 1、主要有：培養瓶，血清瓶，小青瓶，移液管，離心管，試管，培養皿等。

2、清洗步驟：

泡在含有洗潔凈的自來水中→撈出來用毛刷將實驗器具各個面刷洗至少25遍→自來水沖洗25遍→過一遍一蒸水→泡入鉻酸,過夜(24h左右)→從鉻酸中撈出器具，自來水沖洗25遍→過三遍一蒸水，三遍三蒸水→烘箱內烘干→收入柜子備用→用前高溫滅菌(121℃，25min)→烘干→使用。

注意：新的玻璃器具先要泡鹽酸1天，然后清洗步驟與上面相同。

l 塑料類

1 塑料類器具主要包括：孔板，大槍頭，瓶蓋，濾器，*等。

2 清洗步驟：

(1)孔板，*

泡在有洗潔凈的自來水中→用超聲清洗儀超聲3遍(每遍1小時，200C)→在含有洗潔凈的自來水中用毛刷或者紗布將各個面刷洗至少25遍→過一遍一蒸水→泡入鹽酸過一個禮拜→從鹽酸中撈出后自來水沖洗25遍→過三遍一蒸水(每遍3次)，三遍三蒸水→烘箱內烘干→收入柜子→用前包裝好照鈷→使用

(2)大槍頭，蓋子，濾器

在含有洗潔凈的自來水中用毛刷或者紗布將各個面刷洗至少25遍→用超聲清洗儀超聲1遍(每遍45分鐘，200C)→自來水沖洗→過三遍一蒸水(每遍3次)，三遍三蒸水→烘箱內烘干→收入柜子→用前包裝好滅菌→使用

注意：(1)烘孔板時溫度不應太高，烘干后用報紙包裹，裝入箱子內，照鈷，便可使用。

(2) 新的培養瓶蓋子泡舊5%*1天→再用2%NaOH煮20min →自來水沖洗→洗潔精清洗→用超聲清洗儀超聲1遍(每遍45分鐘，200C)→沖洗15遍→過三遍一蒸(每遍3次)→過三遍三蒸水→烘干使用

(二)包裝與消毒

2、包裝

洗干凈的器皿烘干后取出用牛皮紙(油光紙)等包裝，以便于消毒儲存及防止灰塵和再次被污染。比如小青瓶，試管，移液管，血清瓶，培養瓶，離心管，孔板，槍頭，針式濾器等的包裝。其中針式濾器包裝之前要裝好濾膜，安裝濾膜時注意光面朝上(凹向上)，然后將螺旋稍微擰松一些，放入鋁盒中 。

2.1 包裝分類

局部包裝：較大瓶皿如細胞培養瓶，燒杯，容量瓶，三角瓶， 消毒筒以及體積較小，但瓶口包裝方便的容器如*瓶等的包裝，通常采用局部包裝。

全包裝：體積較小的培養瓶皿，注射器，ELISA試劑盒膠塞及不便局部包裝的用具如金屬器械等，需采用全包裝，現多采用直接裝入鋁飯盒的方法。用鋁飯盒來封裝小培養瓶，膠塞和膠帽等很好，但往往因蓋不嚴緊使用期限不宜太長。因鋁飯盒不透明，在蓋子宜寫上用品名稱以便于確認，吸管在裝入消毒筒之前，先用少許脫脂棉將吸管接口端堵塞，松緊度適宜，過松易脫落，過緊不透氣，妨礙使用;然后裝入消毒筒中，消毒筒底部應墊以軟紙或棉花以防吸管裝入時折斷管尖;zui后再包裝入筒中封口。