現在ELISA試劑盒除非是測定抗體的以外，一般使用的是雙抗體夾心法，此種方法大多數用的是增強的雙抗體夾心法，即使用*-親和素系統，還有少數的指標可能使用競爭法，這類方法適用于半抗原的測定。
具有復雜結構的多表位蛋白抗原，其雙抗體夾心法中的一個抗體必須用單抗，否則背景很高。當然如果兩個都是單抗(這兩個單抗針對不同表位)，那么測定的線性范圍就較寬，試劑盒性能就較好；一個用單抗，一個用多抗，測定的靈敏度會較高。
某些簡單的化合物用ELISA試劑盒測定時，因為沒有兩個或以上的表位，一般只能作為半抗原，只能用競爭法測定。如果你發現有測定簡單化合物(如雌激素、NO等)用雙抗體夾心法作測定原理時，這個試劑盒你就要懷疑了。另外還要說明一步雙抗體夾心法與兩步雙抗體夾心法的區別。
一步雙抗體夾心法的吸光度-劑量曲線呈鐘形，隨著待則標本中抗原濃度的增加而升高至一定程度后，測定吸光度即隨抗原濃度的增加而開始下降直至不顯色，即所謂的“鉤狀效應"(hookeHect)，也就是我們在免疫沉淀試驗中所稱的“帶現象"(zonephenomenon)。所以當使用一步雙抗體夾心法時，樣品濃度太高，有時會出現測不出來的現象，此時要作適當的稀釋才能準確測定。
試劑盒的組成：用雙抗體夾心法作為測定的方法時，ELISA試劑盒的組成一般包括： 已包被單抗的酶標板：一塊，有96孔的，也有48孔的，可拆缷，外面有鋁箔袋密封，打開后有干燥劑，實驗時暫未使用的酶標條要連帶干燥劑密封好，放在4℃冰箱中妥善保存。
