培養基細胞的裂解提取和濃縮方法

培養基的裂解提取方法：

    1、分別取-70℃保存的各組動物的樣品（半個腦、0.5g肌肉），放入小離心管中，在冰浴上以PBS充分洗滌2次，除去殘留血液。

　　2、用無菌*和鑷子將大鼠肌肉剪碎（腦樣品不用剪碎），放入另一小離心管中，于0℃以PBS充分洗滌，4℃，3000 rpm離心5分鐘。

　　3、吸出上清夜，盡量將管壁上的液滴吸凈，將培養基組織碎片轉移至組織勻漿管內。

　　4、取2ml的裂解緩沖液（預冷至0℃），加入20μlAprotonin,20μl Trypsin，20μl NaoN4,20μl的PMSFb,20μl的leupeptins和2μl的DTT，混勻后加入勻漿管內，在組織勻漿器上冰水浴勻漿，注意轉速不?0000 rpm。4℃放置2h，10000 rpm 4℃離心10分鐘(可延長)，吸取上清液（蛋白液）-20℃保存。

細胞培養基濃縮方法：

    （一）透析袋濃縮法

　　利用透析袋濃縮培養基溶液是應用zui廣的一種。將要濃縮的蛋白溶液放入透析袋（無透析袋可用玻璃紙代替），結扎，把高分子（6 000－12 000）聚合物如聚乙二醇（碳蠟）、聚乙烯吡咯、烷酮等或蔗糖撒在透析袋外即可。也可將吸水劑配成30％－40％濃度的溶液，將裝有蛋白液的透析袋放入即可。吸水劑用過后，可放入溫箱中烘干或自然干燥后，仍可再用。

　　（二）冷凍干燥濃縮法

　　這是濃縮培養基的一種較好的辦法，它既使培養基不易變性，又保持培養基中固有的成分。它是在冰凍狀態下直接升華去除水分。具體做法是將蛋白液在低溫下冰凍，然后移置干燥器內（干燥器內裝有干燥劑，如NaOH、CaCl2和硅膠等）。密閉，迅速抽空，并維持在抽空狀態。數小時后即可獲得含有蛋白的干燥粉末。干燥后的培養基保存方便，應用時可配成任意濃度使用。也可采用凍干機進行冷凍干燥。

　　（三）吹干濃縮法

　　將蛋白溶液裝入透析袋內，放在電風扇下吹。此法簡單，但速度慢，且溫度不能過高，不要超過15℃。

　　（四）超濾膜濃縮法

　　此法是利用微孔纖維素膜通過高壓將水分濾出，而培養基存留于膜上達到濃縮目的。有兩種方法進行濃縮：一種是用醋酸纖維素膜裝入高壓過濾器內，在不斷攪拌之下過濾；另一種是將蛋白液裝入透析袋內置于真空干燥器的通風口上，負壓抽氣，而使袋內液體滲出。

　　（五）凝膠濃縮法

　　選用孔徑較小的凝膠，如SephadexG25或G50，將凝膠直接加入蛋白溶液中。根據干膠的吸水量和蛋白液需濃縮的倍數而稱取所需的干膠量。放入冰箱內，凝膠粒子吸水后，通過離心除去。

　　（六）濃縮膠濃縮法

　　濃縮膠是一種高分子網狀結構的有機聚合物，具有很強的吸水性能。每克干膠可吸水120ml～150ml。它能吸收低分子量的物質，如水、葡萄糖、蔗糖、無機鹽等，適宜濃縮10 000分子量以上的生物大分子物質。濃縮后，培養基的回收率可達80％～90％。比濃縮膠應用方便，直接加入被濃縮的溶液中即可。必須注意，濃縮溶液的pH值應大于被濃縮物質的等電點，否則在濃縮膠表面產生陽離子交換，影響濃縮物質的回收率。