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堿裂解法提取大量質粒

閱讀:700發布時間:2012-3-24

該法是R.Treisman尚未發表的方法,同時也是Brinboim和Doly(1979)及Ish-Horowicz和Burke(1981)所用方法的改進。該方法對于目前使用的所有大腸菌菌株都卓有成效,并可與隨后的純化步驟,如聚乙二醇沉淀或氯化銫-溴化乙錠梯度平衡離心等,一并聯合使用。注:括號中給出的體積可適用于未經*處理的培養。

試驗準備:
1、 溶液I:50mmol/L葡萄糖 25mmol/L Tris.Cl(pH8.0) 10mmol/L EDTA(pH8.0)溶液I可成批配制,在10 lbf/in2(6.895x104Pa)高壓下蒸氣滅菌15min,貯存于4℃。
2、 溶液Ⅱ: 0.2mol/L NaOH(臨用前用10mol/L貯存液現用現稀釋)1%SDS 蓋緊瓶蓋,緩緩顛倒離心瓶數次,以充分混勻內容物。于室溫放置5-10分鐘。當溶液的pH值低于8.0時,*不能有效工作。防止NaOH接觸空氣中的CO2所以要現用現配。
3、 溶液Ⅲ:5mol/L乙酸鉀 60ml 冰乙酸 11.5ml 水 28.5ml。所配成的溶液對鉀是3mol/L,對乙酸根是5mol/L。
4、 *溶液: 10mg/ml,溶于10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)。

試驗步驟:
1、 將冼過的500ml 培養物的細菌沉淀物,重懸于10ml(18ml)溶液I中。
2、 加1ml(2ml)新配制的*溶液。
3、 加20ml(40ml)新配制的溶液Ⅱ。
4、 加15nl(20ml)用冰預冷的溶液Ⅲ。封住瓶口,搖動離心瓶數次以混勻內容物,此時應不再出現分明的兩個液相。于冰上放置10min,會出現一白色絮狀沉淀。沉淀應包括染色體DNA、 高分子量RNA和鉀-SDS-蛋白質-膜復合物。
5、 用SorvallGS3轉頭(或與其相當的轉頭)于4℃以4000rpm離心15min,使轉頭自然停止轉動。如果細菌碎片貼壁不緊,則可以5000rpm再度離心20min, 然后盡可能將上清全部轉到另一瓶中,棄去殘留在離心管內的粘稠狀液體。未能形成致密沉淀塊通常是由于溶液Ⅲ與細菌裂解物混合不充分。
6、 用4層干酪包布把上清過濾至一250ml離心瓶中,加0.6體積的異丙醇,充分混勻,于室溫放置10min。
7、 用Sorvall GS3轉頭(或與其相當的轉頭)于室溫以500rpm離心15min,回收核酸。鹽也會在4℃離心時沉淀下來。
8、 小心倒掉上清,敞開瓶口倒置離心瓶使殘余上清液流盡,室溫下用70%乙醇洗滌沉淀。倒出乙醇,并除去附于瓶壁的所有液滴,室溫下將瓶倒置放在紙巾上,使zui后殘余的痕量乙醇揮發*。
9、 用3ml TE(pH8.0)溶解核酸沉淀。
 

 


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