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膠體金標記蛋白的純化

閱讀:715發布時間:2011-12-3


(1)超速離心法:根據膠體金顆粒的大小,標記蛋白的種類及穩定劑的不同選用不同的離心速度和離心時間。

用BSA做穩定劑的膠體金—羊抗兔IgG結合物可先低速離心(20nm金膠粒用1 200r/min,5nm金膠粒用1 800r/min)20min,棄去凝聚的沉淀。然后將5nm膠體金結合物用6 000g,4℃離心1h;20nm~40nm膠體金結合物,14 000g,4℃離心1h。仔細吸出上清,沉淀物用含1%BSA的PB液(含0.02%NaN3),將沉淀重懸為原體積的1/10,4℃保存。如在結合物內加50%甘油可貯存于-18℃保存一年以上。

為了得到顆粒均一的免疫金試劑,可將上述初步純化的結合物再進一步用10%~30%蔗糖或甘油進行密度梯度離心,分帶收集不同梯度的膠體金與蛋白的結合物。

(2)凝膠過濾法:此法只適用于以BSA作穩定劑的膠體金蛋白結合物的純化。將膠體金蛋白結合物裝入透析袋,在硅膠中脫水濃縮至原體積的1/5~1/10。再經1 500r/min離心20min。取上清加至Sephacryl S-400(丙烯葡聚糖凝膠S-400)層析柱分別純化。層析柱為0.8 cm×20cm,加樣量為床體積的1/10,以0.02Mol/L PBS液洗脫(內含0.1%BSA,0.05%NaN3,pH8.2者用IgG標記物),流速為8ml/h。

按紅色深淺分管收集洗脫液。一般先濾出的液體為微黃色,有時略混濁,內含大顆粒聚合物等雜質。繼之為純化的膠體金蛋白結合物,隨濃度的增加而紅色逐漸加深,清亮透明,zui后洗脫出略帶黃色的為標記的蛋白組分。將純化的膠體金蛋白結合物過濾除菌、分裝,4℃保存。zui終可得到70%~80%的產量。
 


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