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上海酶聯(lián)生物研究所
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上海酶聯(lián)生物研究所
閱讀：466發(fā)布時(shí)間：2011-10-24
（一） 原理
免疫電鏡技術(shù)是免疫化學(xué)技術(shù)與電鏡技術(shù)結(jié)合的產(chǎn)物，是在超微結(jié)構(gòu)水平研究和觀察抗原、抗體結(jié)合定位的一種方法學(xué)。它主要分為兩大類：一類是免疫凝集電鏡技術(shù)，即采用抗原抗體凝集反應(yīng)后，再經(jīng)負(fù)染色直接在電鏡下觀察；另一類則是免疫電鏡定位技術(shù)。該項(xiàng)技術(shù)是利用帶有特殊標(biāo)記的抗體與相應(yīng)抗原相結(jié)合，在電子顯微鏡下觀察，由于標(biāo)準(zhǔn)物形成一定的電子密度而指示出相應(yīng)抗原所在的部位。免疫電鏡的應(yīng)用，使得抗原和抗體定位的研究進(jìn)入到亞細(xì)胞的水平。
（二）影響免疫電鏡的一些因素
1．標(biāo)記物
用于電鏡觀察的標(biāo)記物有三類：一類是電子密度致密的標(biāo)記物，如鐵蛋白、辣根過氧化物酶等。另一類則是放射性同位素，如135I、35S、32P、14C、3H等，第三類則是有*形狀的標(biāo)記物，如血蘭蛋白、噬菌體等。
對(duì)標(biāo)記物的要求是：具有特定的形狀、不影響抗原抗體復(fù)合物的特性與形狀。目前用于免疫電鏡的標(biāo)記物主要是鐵蛋白和HRP。兩者各有其優(yōu)點(diǎn)，鐵蛋白電子密度致密。觀察時(shí)反差大，優(yōu)于酶標(biāo)記，但鐵蛋白分子量大（460
000），穿透能力差，所以適于細(xì)胞表面抗原的定位，另外鐵蛋白的標(biāo)記過程比較復(fù)雜。HRP分子量?。?0
000），穿透力強(qiáng)，有利于標(biāo)記抗體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，適于細(xì)胞內(nèi)的抗原定位。
2．固定劑
固定是免疫電鏡較關(guān)鍵的一步，免疫電鏡中的固定與一般超薄切片中的固定的不同之點(diǎn)在于既考慮保存細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu),又要考慮到抗原的失活性問題。
（1）
固定劑的要求：①不損害細(xì)胞內(nèi)抗原的活性；②固定速度快、效果好；③分子量小，易于滲透；④固定后,不引起交聯(lián)，造成空間的阻礙，影響標(biāo)記抗體進(jìn)入抗原位。
（2）
影響固定的因素有：①采用固定劑的種類；②固定劑的濃度，濃度過大，對(duì)抗原的活性有影響，濃度過小，固定效果差；③固定劑的pH；④固定劑的溫度,一般采用2℃～4℃冷固定；這樣能降低細(xì)胞的自浴作用和水分的抽提；⑤固定時(shí)間與溫度有關(guān)，溫度高，固定快，也與緩沖系的離子強(qiáng)度有關(guān)，離子強(qiáng)度大，滲透壓大，穿透力強(qiáng)，固定要快。不同的固定劑，或同一固定劑的不同濃度所需的固定時(shí)間也不一致；⑥與被固定的細(xì)胞類型有關(guān)。
目前常用的固定系統(tǒng)有：4%聚甲醛，1.5%～2%戊二醛，1%多聚甲醛＋1%戊二醛，4%多聚甲醛＋0.5%苦味酸＋0.25%戊二醛，96%乙醇＋1%醋酸。不論采用哪些系統(tǒng)，使用前必須用已知效價(jià)的抗原做一系列預(yù)實(shí)驗(yàn)。如固定劑的種類濃度、溫度、pH及固定時(shí)間等。然后做出預(yù)處理的效價(jià)，作為失活參考以再選擇zui適條件。
3．非特異性吸附
非特異性吸附與酶標(biāo)抗體、抗血清的稀釋度、染色時(shí)間，溫度及介質(zhì)等有關(guān)，其中zui主要的是抗血清及標(biāo)記抗體的稀釋。一般認(rèn)為價(jià)抗血清或標(biāo)記抗體稀釋到低蛋白濃度，用于標(biāo)記染色可獲得的結(jié)果。因?yàn)榈偷鞍诐舛扔欣诮档头翘禺愋晕?。?shí)際應(yīng)用的蛋白濃度大致在0.50mg/ml～2mg/ml。工作效價(jià)一般在1︰20～1︰400,在實(shí)際工作中，將標(biāo)記抗體或抗血清稀釋到1︰100倍以上則可獲得理想的陽性結(jié)果，而非特異性吸附必然降得很低。
工作濃度的選擇是將標(biāo)記抗體或抗血清作1︰2、1︰4、1︰8……1︰256的稀釋，做已知陽性標(biāo)本的標(biāo)記染色觀察，取其陽性沉積物明顯，而非特異性吸附zui低的一稀釋度做為工作濃度。
4．標(biāo)記染色法
標(biāo)記染色法分為直接染色法與間接染色法兩種。前者的特點(diǎn)是特異性較高,敏感性低，標(biāo)記抗體只能用于檢測(cè)一種抗原。后者敏感性較強(qiáng)，一種標(biāo)記抗體可用于多種抗原的檢測(cè)。缺點(diǎn)是特異性較差。
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