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上海酶聯生物研究所
上海酶聯生物研究所
閱讀：435發布時間：2011-12-14
免疫共沉淀和親和層析共分離：
免疫共沉淀是證明蛋白質-蛋白質相互作用的zui直接zui經典和zui有效的方法，如蛋白A能與B相互作用結合成異源二聚體，無論用抗A或抗B的抗體或與A或B的親和物偶聯的agarose小珠都能把A和B沉淀下來。因此廣泛用于蛋白質相互作用研究。
常用的小珠：
GST-Agarose（不需要抗體）
ProteinA-Agarose（用時需加抗體）
基本方法：
1.表達蛋白質A
2.蛋白質A與親和小珠結合
3.用結合有蛋白質A的親和小珠調取細胞破碎液中蛋白質B
4.離心、洗滌親和小珠若干次
5.處理親和小珠使蛋白質A、B解吸附（可以直接用SDS-PAGE上樣BUFFER煮）
酵母雙雜交系統
基本原理，以酵母S.cerevisiae的轉錄因子GAL4系統為例
GAL4有兩個結構上互相分開，功能上相互獨立的結構域。
N 端1-147aa與DNA結合（DNA binding domain,BD）。
C端768-881aa能激活轉錄（Activation Domain,AD）。
BD＋AD—能激活GAL4效應基因的上游激活序列（UAS）。
把N和C分開分別構建成兩種表達質粒。如把Gal4的N端和誘餌蛋白（研究的目標蛋白A）融合表達，把細胞cDNA和C端融合表達，cDNA編碼的蛋白x如能和A互相作用,就能把Gal4N端C端和N端在一起，就可以激活UAS下游的基因表達。
半乳糖苷酶（Laz）基因克隆到URA3的下游。
在x-Gal的存在下酵母菌落成藍色（Fields）
酵母GAL4基因缺失；GAL80基因缺失（GAL4的負調控因子）
方法略
假陽性多，因此還必須再用免疫共沉淀等直接證據證明
發展：哺乳動物雙雜交系統、二倍體雙雜交系統、酵母單雜交系統、細菌雙雜交系統、酵母三雜交系統
FAR WESTERN
Western blot 是免疫印記，而Far western 是蛋白質鋪蓋技術，兩者其實在本質上是相似的，只是免疫印記是直接用抗體去檢測抗原，常用于蛋白質定性；而Far western則是用標記的蛋白（125I或熒光）去probe與之相互作用的蛋白，或再用抗這種蛋白的抗體顯示這種蛋白的結合位置，用于研究蛋白質的相互作用。
基本步驟：
1.表達和提純獲得蛋白A，并作熒光或放射性標記，或制備抗A抗體
2.細胞總蛋白SDS-PAGE（一起染色，另一塊轉膜）
3.電轉膜
4.封閉
5.加入蛋白A，如A帶標記，洗膜后直接顯影；如未標記，可加抗A抗體再加二抗或標記的蛋白A。
優點：簡單、經濟
缺點：SDS-PAGE影響蛋白質構象，可能影響相互作用
表面等離子共振（SPR）法原理：SPR法是生物科學、物理學和計算科學結合的方法，在玻璃表面鍍上一層金薄膜，再把目標蛋白通過氨基共價偶聯在金膜表面制成傳感芯片。當一束偏振光照射到傳感芯片的金膜時會引起金屬中的電子共振，而導致反射光會在一定角度內大大減弱，其中反射光*消失的角度稱為共振角。共振角會隨著金膜表面通過的液相的折射率的改變而改變，而折射率的改變又與結合在金膜表面的生物大分子的質量成正比，每結合1ng/mm2折射率的變化相當于1000RU（共振單位），如果通過的液相中有能與膜表面偶聯的靶蛋白相互作用而結合的蛋白質或其它化學物，就使結合在金膜表面的生物大分子質量增加，檢測的共振單位（RU）也增加。通過光檢測單元檢測反射光的變化，經數據處理系統處理后，獲得實時傳感圖。特點： 1.靈敏度，所需樣品少（20μl就可分析）2.可以同時確定互相作用動力學參數Ka、Kd值3.可以測蛋白質-蛋白質互相作用，也可測蛋白質與共它分子互相作用（小分子化合物、多肽、蛋白質、寡核苷酸、寡聚糖、類脂、噬菌體、病毒和細胞）（4）可以回收結合的蛋白進一步研究和鑒定（如質譜分析）SPR分析的條件控制：樣品制備：樣品的PH、離子強度，對相互作用有顯著影響，一般PH范圍在6.8-7.8之間，低離子強度，樣品中蛋白質濃度變化影響不大，樣品體積20-50μl。溫度：一般25℃+5℃，溫度高于30℃對相互作用有影響進流速：全程流速恒定，進樣速度不宜過快，保證接觸時間，一般進樣速度5-10μl/分所需儀器：生物分子相互作用儀（如Biocore X型）分析軟件：如BLAevaluation（Version3.1）軟件。
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