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上海酶聯(lián)生物研究所
上海酶聯(lián)生物研究所
閱讀：393發(fā)布時間：2011-8-23
質粒是攜帶外源基因進入細菌中擴增或表達的主要載體，它在基因操作中具有重要作用。質粒的分離與提取是zui常用、zui基本的實驗技術。
質粒的提取方法很多，大多包括3個主要步驟：細菌的培養(yǎng)、細菌的收集和裂解、質粒DNA的分離和純化。本實驗以堿裂解法為例，介紹質粒的抽提過程。
實驗目的：掌握堿裂解法抽提質粒的原理、步驟及各試劑的作用。
實驗材料：含有質粒pUC18載體的大腸桿菌菌液，克隆有水稻外源片段的BAC的大腸桿菌菌液。
實驗原理：在pH 12.0 ~ 12.6堿性環(huán)境中，細菌的線性大分子量染色體DNA變性分開，而共價閉環(huán)的質粒DNA雖然變性但仍處于拓撲纏繞狀態(tài)。將pH調至中性并有高鹽存在及低溫的條件下，大部分染色體DNA、大分子量的RNA和蛋白質在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而質粒DNA仍然為可溶狀態(tài)。通過離心，可除去大部分細胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質，質粒DNA尚在上清中，然后用酚、氯仿抽提進一步純化質粒DNA。
實驗步驟：
1. 取含有pUC18質粒的大腸桿菌菌液于LA培養(yǎng)基上37℃過夜培養(yǎng)；
2. 用無菌牙簽挑取單菌落，接種于含有Amp抗生素的LB培養(yǎng)基中，37℃搖床~250 r/min過夜培養(yǎng)；
3. 吸取1.5 ml菌液，12000 g離心2分鐘，收集菌體，倒掉菌液；吸取1.5 ml菌液，再次收集菌體，盡量將菌液倒干凈；
4. 加入300 ?l溶液 I振蕩打勻，重新懸浮細胞，震蕩混勻（注意：應*打勻沉淀或碎塊）；
5. 加入300 ?l溶液II，輕柔顛倒混勻，放置至清亮，一般不超過5分鐘；
6. 加入300 ?l溶液III顛倒混勻，放置于冰上10分鐘，使雜質充分沉淀；
7. 12000 g離心10分鐘；
8. 吸取800 ?l上清液（注意：不要吸取到飄浮的雜質）至另一Eppendorf管中，加入2/3體積的異丙醇，室溫下放置5分鐘；
9. 12000 g 常溫離心15分鐘；
10. 倒盡上清，加75％乙醇浸洗除鹽（放置片刻或離心3分鐘后倒去上清）；
11. 室溫放置或超凈臺上風干DNA；
12. 加40 ?l滅菌超純水或TE溶解；
13. 質粒、BAC的質量檢測，于-20℃保存。
附注：質粒檢測
電泳檢測：質粒電泳一般有三條帶，分別為質粒的超螺旋、開環(huán)、線型三種構型
吸光值檢測：采用分光光度計檢測260nm、280nm波長吸光值，若吸光值260nm/280nm的比值介于1.7－1.9之間，說明質粒質量較好，1.8為*，低于1.8說明有蛋白質污染，大于1.8說明有RNA污染。
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