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上海酶聯生物研究所
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閱讀：746發布時間：2011-7-6
免疫熒光技術
熒光免疫技術是標記免疫技術中發展zui早的一種。很早以來就有一些學者試圖將抗體分子與一些示蹤物質結合，利用抗原抗體反應進行組織或細胞內抗原物質的定位。Coons等于1941年采用熒光素進行標記而獲得成功。這種以熒光物質標記抗體而進行抗原定位的技術稱為熒光抗體技術（fluorescentantibodytechnique）。
熒光免疫法按反應體系及定量方法不同，還可進一步分做若干種。與放射免疫法相比，熒光免疫法無放射性污染，并且大多操作簡便，便于推廣。國外生產的TDM用試劑盒，有相當一部分即屬于此類，并且還有TDM熒光偏振免疫分析用的自動分析儀生產。
由于一般熒光測定中的本底較高等問題，熒光免疫技術用于定量測定有一定困難。近年來發展了幾種特殊的熒光免疫測定，與酶免疫測定和放射免疫分析一樣，在臨床檢驗中應用。
有關熒光的基本知識
一、熒光現象
（一）熒光的產生
一此化學物質能從外界吸收并儲存能量（如光能、化學能等）而進入激發態，當其從激發態再回復到基態時，過剩的能量可以電磁輻射的形式放射（即發光）。
熒光發射的特點是：可產生熒光的分子或原子在接受能量后即刻引起發光；而一旦停止供能，發光（熒光）現象也隨之在瞬間內消失。
可以引起發熒光的能量種類很多，由光激發所引起的熒光稱為致熒光。由化學應所引起的稱為化學熒光，由X線或陰極射線引起的分別稱為X線熒光或陰極射線熒光。熒光免疫技術一般應用致熒光物質進行標記。
（二）熒光效率
熒光分子不會將全部吸收的光能都轉變成熒光，總或多或少地以其他形式釋放。熒光效率是指熒光分子將吸收的光能轉變成熒光的百分率，與發射熒光光量子的數值成正比。
熒光效率＝發射熒光的光量分子數（熒光強度）／吸收光的光量子數（激發光強度）
發射熒光的光量子數亦即熒光強度，除受激發光強度影響外，也與激發光的波長有關。各個熒光分子有其特定的吸收光譜和發射光譜（熒光光譜），即在某一特定波長處有zui大吸收峰和zui大發射峰。選擇激發光波長量接近于熒光分子的zui大吸收峰波長，且測定光波量接近于zui大發射光波峰時，得到的熒光強度也zui大。
（三）熒光的猝滅
熒光分子的輻射能力在受到激發光較長時間的照射后會減弱甚至猝滅，這是由于激發態分子的電子不能回復到基態，所吸收的能量無法以熒光的形式發射。一些化合物有天然的熒光猝滅作用而被用作猝滅劑，以消除不需用的熒光。因此熒光物質的保存應注意避免光（特別是紫外光）的直接照射和與其他化合物的接觸。在熒光抗體技術中常用一些非熒的色素物質如*、堿性復紅。伊文思藍或低濃度的過錳酸鉀、碘溶液等對標本進行得當復染，以減弱非特異性熒光本質，使特異熒光更突出顯示。
二、熒光物質
（一）熒光色素
許多物質都可產生熒光現象，但并非都可用作熒光色素。只有那些能產生明顯的熒光并能作為染料使用的有機化合物才能稱為免疫熒光色素或熒光染料。常用的熒光色素有：
1．異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC）為黃色或橙黃色結晶粉末，易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4，zui大吸收光波長為490495nm，zui大發射光波長520530nm，呈現明亮的黃綠色熒光，結構式如下：
有兩種同分異結構，其中異構體Ⅰ型在效率、穩定性、與蛋白質結合能力等方面都更好，在冷暗干燥處可保存多年，是應用zui廣泛的熒光素。其主要優點是：①人眼對黃綠色較為敏感，②通常切片標本中的綠色熒光少于紅色。
2．四乙基羅丹明（rhodamine，RIB200）為橘紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮。性質穩定，可長期保存。結構式如下：
zui大吸收光波長為570nm，zui大發射光波長為595～600nm，呈橘紅色熒光。
3．四甲基異硫氰酸羅丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate，TRITC）結構式如下：
zui大吸引光波長為550nm，zui大發射光波長為620nm，呈橙紅色熒光。與FITC的翠綠色熒光對比鮮明，可配合用于雙重標記或對比染色。其異硫氰基可與蛋白質結合，但熒光效率較低。
（二）其他熒光物質
1．酶作用后產生熒光的物質某些化合物本身無熒光效應，一旦經酶作用便形成具有強熒光的物質。例如4-甲基傘酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基傘酮，后者可發出熒光，激發光波長為360nm，發射光波長為450nm。其他如堿性酸酶的底物4-甲基傘酮磷酸鹽和辣根過氧化物酶的底物對羥基苯乙酸等。
2．鑭系螯合物某些3價稀土鑭系元素如銪（Eu3+）、鋱（Tb3+）、鈰（Ce3+）等的螯合物經激發后也可發射特征性的熒光，其中以Eu3+應用zui廣。Eu3+螯合物的激發光波長范圍寬，發射光波長范圍窄，熒光衰變時間長，用于分辨熒光免疫測定。
免疫學基本常識：抗原、抗體及單克隆抗體
*，人或動物可以依靠自身的能力抵御某些疾病的侵襲，也有一些疾病可以通過機體自身調控而自愈，這是因為機體內部存在一個免疫系統。免疫系統是由中樞免疫組織（骨髓、胸腺、消化系統免疫組織）和外周淋巴組織（淋巴結和脾臟）的免疫活性細胞（B淋巴細胞、漿細胞），以及由它們產生的多種淋巴因子和抗體所組成。免疫系統對外來物質產生一系列反應的過程稱為免疫，而這種反應本身則稱為免疫應答。能夠在機體中引起特異性免疫應答的物質稱為抗原，免疫應答的結果則是刺激機體產生與抗原相對應的特異性抗體和引起細胞免疫。
由于免疫應答同時取決于機體，而不僅是進入機體的物質，所以抗原的定義是相對的。由此，按照免疫應答的效果可以將抗原分為*抗原和半抗原：*抗原是指能夠直接誘導機體產生特異性免疫應答的一類物質。*抗原的分子量都大于5000，其化學成分多為蛋白質或脂多糖，其它如脂蛋白，糖蛋白，多糖體，多肽，核酸等也都是*抗原。半抗原能與抗體特異性結合，但不能激發機體產生抗體，必須與蛋白質（載體）結合后進入機體，才能產生有效的免疫應答。大分子的半抗原在體外能與對應的抗體結合發生可見反應（凝集、沉淀），小分子的半抗原能與對應抗體結合而不出現可見反應。此外，抗原還可以按照自身的物質屬性分為可溶性（毒素、異種蛋白）或顆粒性（細菌、細胞）抗原，或按臨床意義分為外源性和內源性抗原。
抗體是在抗原刺激下機體免疫應答的產物。所有抗體都具有與抗原特異性結合的能力。抗體的化學本質是免疫球蛋白即γ－球蛋白。不過只有當免疫球蛋白針對已知抗原時，才能夠稱這種免疫球蛋白為抗體。免疫球蛋白屬于結構牢固的分子物質，可以經受較大變化的環境作用，諸如56℃加溫，在室溫下較長時期的貯藏，短期高或低pH處理，甚至與去污劑或尿素接觸后仍保持其抗體活性。
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